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硒蛋氨酸对人前列腺癌DU145细胞增殖与凋亡的影响

03/16

第9卷帮6斓2008年12月

北‘芦大学学撮(魏然科学版)

JOURNALOFBEIlIUA

V01.9No.6Dec.2(的8

UNIVERSITY(NaturalScience)

交章缡号:t009-4822(2008)06-0513-05

硒蛋氨酸对人前列腺癌DU145细胞增殖与凋亡的影响

刘艳波1,一,芦丽莉1,葛

贺1,越丽娟2,董妍3,赵雪俭2

(1,建华大学基础暇学茨,吉辣蠢林132013;2.密林大学基础医攀院,吉毒l£长春130021;

3。美蕊柱兰大学RoswellPark瘗诧擎藏治教磷室,美露窜法罗100029)

摘要:网的观察硒蛋氮酸(selenome—thionine)对DUl45前列腺癌细胞增殖殿凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法采用MTT比色法观察1.25,2.50,5.00I且mol・L“硒蛋氨酸对DUl45细胞增殖活力的抑制作用;吖蓰橙染色烧察硒蛋氨酸诱蛰缨魏臻亡精魏;漉式缨缒零分析缨悠餍麓及凋亡,并诗葬缨麓孚均鹅亡指数;免疫缨羟霓攀按术麓察缨藤蠹激滔酶caspase3戆表达情嚣.缕栗经1.筋,2。筠,5。00蝤m蘸・L‘硒蛋氮酸处理舔h看,DUl45细胞生长抑制率分别为t6.35%,38.10%和73.54%,3组闯比较差弊肖避著性(P《0。01);随硒蛋氨酸浓度升粥细胞生长抑制率增加,呈明显的剂赞依赖性.吖啶擞荧光染色可见缎1.25,2.50,5.00Ixmol・L。1硒蛋氨酸处理后的细胞呈明显凋亡形态,并随药物剂量增加凋亡细胞数增多;流式细胞术结果显示,经1.25,2.50,

5。00

p。mol・L。硒蛋氢酸处瑾48h磊,英缎髓麓凋亡率分裂为5.34%,8。7t%秘t3.6%,3组瓣毙较差舅毒显著

性(P《0。05),隧硒蛋氨酸浓度秀赢缨魏魏亡率舞裹,呈裁登依赖关系;受疫翅稔化学染色结聚显示,蘧善磋蘩氨酸剂避增加,细胞内激活的easpase3表达上调.结论硒鬣氨酸对DUl45细胞具有明显的抑制作用,其机制可能与激满的caspase途襁诱导细胞凋亡有关+关键词:细胞凋亡;硒蛋氨酸;前列腺肿瘤;缨胞周期孛瑟分类警:R737,25

文豢拣识碣:A

EffectofSelenome-thionine

on

ApoptosisandProliferationof

ProstaticCancerCellsDUl45

LIUYah.b01”,LU

Li—li,GE

Hel,ZHAO

Li-juan2,DONG

Yan3,ZHAO

Xue-jian2

(J.BasicMedicalCollegeofBeihuaUniversity,Jilin132013,China;

2.Basic

3。Department

MedicalCollegeofJilinUniversity,Changchun130021,China;

ParkCancerInstituteTulan

ofCancerChemoprevention,RosweHUniversity,Buffalo100029,USA)

Abstract:Objective

cancer

Toobservetheeffectofselenome—thionine

on

proliferationandapoptosisofprostatic

cellsDUl45andapproachthe

mechanism.Methods

AtierDUl45cellsweretreatedwithI.25.2.50

and5。00Ixmol・L—selenome.thionine.thecellviabilitywasexaminedbyMTTtest。Thetechniquesofacridineorangestainingandflowcytometrywereused

to

analyzeapoptoticcycleandcalculatetheapoptotie

DUl45

cells

index。Theexpressionofactivecaspase3wasdetectedwithimmunocytochemistry,Results

were

rate

treatedwith1.25。2,50and5.00tLmol・L~selenome.thionineafter48hours,thegrowthinhibitoryofcelllinewas16.35%.38.10%and73.54%respectivelywithdose.dependent。theinhibitoryrate

inereasingofselenome-thionine

concentration

indosedependent

manner.There

increasedwithexisted

obviousdifferenceamongthreegroups(P《0。01)。Acridineorangestainingresultshowed

thattheceils

收稿日期:2008-09-02

基金项尉:吉林省人民政府人才开发基金资助课蹶(2006J1902).

作者简介:划艳波(1974一),瘦,讲师,博士研究嫩。点要从事前列腺瘸发病机制研究.

万方数据 

514were

北华大学学报(自然科学版)

apoptotic

state

第9卷

whentheyweretreatedwith1.25,2.5and5.0ixmol・L~selenome—thionine,thenumber

ofapoptotiecellsincreasedwithincreasingofselenome—thioninedose。Flowcytometryresultsshowedthatwhenthecells

rate

were

treatedwith1.25.2.50and5.00izmol・L~selenome—thionineafter48h,theapoptotic

was

5。34%,8。71%and13。6%respectivelywithdose—dependence,thereexistedobviousdifference

amongthreegroups(P<0.05).The

has

significantanti-tumor

expressionofactivecaspase3

can

was

upregulated

withincreasingof

cancer

selenome—thioninedose。Conclusion¥elenome—thionineDUl45and

caspase・

inducetheapoptosisofprostatic

to

cells

effect,its

mechanismmayberelated

activatethepathwayof

Keywords:Apopt08is;Selenome—thionine;Prostaticneoplasm;Cellcycle

前列腺癌是老年男性高发疾病,2003年仅美

黧发现新病例220900入,死亡逛28900人.前列腺

癌已经成为威胁老年男性健康非常重要的疾病之

一uj.即使进行前列腺癌根治性手术,仍约有30%的患者手术詹复发,因此,激素非依赖性前列腺癌成为治疗研究的又一热点.到目前为此,常规化疗对于激素毫车依赖性鞠转移蒋歹ll腺癌的治疗效果欠

佳,因此,人们正在寻求副作用小而疗效可靠的药

物泣j。硒是入体必需的微量元素之一,人类流行病学研究发现硒的摄入量和癌症发生率呈负相关.硒摄人缺乏往往伴随癌症发生率的增加∞圳,而增加硒的摄人可降低某些癌症的发生率和死亡率,包括前列腺癌、子宫颈癌、直肠癌及乳腺癌等口引.目前,硒元素作为具有防癌抗癌效果勰微量元素,已弓l起学术

界的广泛重视,而网内关于硒蛋氨酸

(methylseleninieacid)抗前歹l腺癌的骈究报道还较少.本实验旨在研究硒蛋氨酸对人前列腺癌细胞系DUl45生长和增殖的影响,并初步探讨其作用机制.-l

材料与方法

1)主要试测:硒蛋氨酸由美国桂兰大学赠送,

四甲基偶氮唑蓝(MTT)为美国Sigma公司产品,激

滔的easpase3多克隧抗体麴子Takara公霭,顺铭

(diamminedichloroplatinum,DDP)为山东齐鲁制药厂生产.

2)细胞系及培养条件:人前列腺癌DUl45细胞株由美国社兰大学赠送,细胞培养于含10%小牛瘟清的DMEM培养液巾,置于37oC,5%CO:漫化的培养箱,待细胞长满80%培养瓶时,分组热药.

3)实验分组:DMEM空白对照组,2

i出mol・Lq

DDP组,硒蛋氮酸i.25,2.50,5.00Ixmol・L。组.

4)细胞形态观察:取对数生长期细胞,调整细胞密度为l×105mL~,接种于24孔板,lmL/孑L。

培养过夜后换瓶鲜的培养液,按前述分组加药,

48

h后倒置显微镜下观察细胞形态.

万 

方数据5)MTT比色法:在96孔培养板,接种细胞l×105/孔,每组4孔,44

h后每孔加MW(5

g・L-1)

20斗L,继续孵育4h吸弃培养液,每孑L加入DMSO

100

txL,震荡10min,用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度值(点),计算细胞生长搀制率,搀簇率》30%为细胞对该药敏感.抑制率=[1一A(试验

组)崩(对照组)]×100%。

6)吖啶橙染色:将10mg吖啶橙溶于100

mL

pH为6。8的PBS中,过滤后4℃避光保存。细胞玻片经药物处理后48h,加入20拉L的吖啶橙储存液,荧光显微镜下观察,拍照.

7)流式细胞仪检测:传代培养的DUl45细旅接种予培养瓶中(1x

106/瓶),次13加药处理,48

矮收集缩您,冷PBS洗2次,一20℃70%的冷乙酵

刚定,加入1.5mL

PI(50mg・L卅)染色。混匀后上

流式纲胞仪做单参数分析,用累积曲线分割法计算

各期细胞比例.

8)免疫细胞化学:将大小适合的盖玻片放入6孔培养板中,接种纲胞力5×105/孑L,37℃5%C02中培养,次日加药,继续培养48h,PBS清洗,4%多聚甲醛固定,常规方法观察细胞内激滔懿caspase3表达情况.

9)统计举处理:数据处理采用SPSS9.0统计软件,细胞生长抑制率及细胞凋亡率用百分率表

示,组闻比较采用独立样本间两两比较的X2检验.

结果

缨胞彩态学观察

空白对照组细胞贴壁牢固,胞质中颗粒较少.

经1。25,2。50,5.00Ixmol・L。硒蛋氨酸处理细胞

48

h后,细胞形态均发生明显改变:细胞呈类圆形,

边缘毛糙不规则,胞质中颗粒增多,贴壁能力下降,艇出现悬浮细胞和细胞碎片,以5。00臻撒ol・L。组最为突出(与DDP组类似).表明硒蛋氨酸体外可以睨显据铡DUl45细惑垒长《觅图1)。

2。{

第6期

洲铯波,等:硐琢钮酸对人前可41杂癌DUl45细胞增殖呵厕亡的影响

515

鞠1

不同粼量的磺蛋氨酸怒灌DUl45缀脆勰h磊的彩态学改变

Fig.1

MorphologychangesofDUl45cellstreatedwithdifferentdosesofselenome—thionineafter48hours

2.2

不同剂量硒甏氨酸对DUl45细胞增殖抑制

与1.25Ixmol・Lt硒蛋氨酸组比较差异具有显著{乍用

性(P<0。05).,

MTU结果显示,经1.25,2.50,5。00txmol・L“硒2.3吖啶橙染色检测细胞凋亡

蛋氨酸处理48h后,DUl45细胞A值分另Ⅱ为0.73士

荧光显微镜观察可觅空白对照组细胞呈均匀0。04,0。54±0。05,0。23

4-0.03,生长抑制率分别为

绿色,形态规则;经l,25,2。50,5.00强mol・L以硒16.35%,38.10%,73.54%,与对照组比较,差异有蛋氨酸处理48h后,DUl45细胞出现不规则橘黄色显著性(P<0.05),且随硒蛋氨酸浓度增加,抑刹颗粒,随着硒蛋氨酸剂量增加,凋亡细胞率逐渐增作用逐渐增强,2。50,5。00p.mol・Lq硒蛋氮酸组

加,望明曼剂量依赖性(见圈2).

图2不同剂道的硒蛋氨酸处理DUl45细胞48h后吖啶橙染色观察细胞凋亡情况

Fig.2

ApoptosisofDUl45cellstreatedwithdifferentdosesof

selenome—thionineafter48hdetectedwithacridineorangestaining

2.4

流式细胞术检测细胞凋亡5.34%,8.71%和13.6%,肿瘤细胞凋亡呈栽量依空南对照纽秃唆显酶凋亡峰.DUl45纲胞经

赖性;细胞周期发生改变,s期和G;期细胞所占比1.25,2.50,5.00

Ixmol・L一硒蛋氨酸处理48h后,

例增多,硒蛋氨酸使细胞的生长阻滞在G,/S期(见

在Gl期前出现明显的凋亡峰;细胞凋亡率分剐为

匿3)。

万 

方数据

516

北华大攀学报(自然科举版)第9卷

凰3不尚剂焘的硒蛋氮酸处瑷纲胞鸱h后流戏绷胞术检测细胞凋意情泥

Fig.3

ApoptosisofDUl45cellstreatedwithdifferentdosesof

selenome-thionineafter48hdetectedwithflowcytometry

2.5

免疫细胞化学染色结果

空白对照组细胞激活的casapae3表达呈弱阳

激活的casapae3表达爨逐渐增加,棕黄色颗粒明显增多,染色增强,以2.50,5.00¨mol・L一组改变明显<冤圈4)+

性,脆浆中只有少爨棕黄色颗粒,经l。25,2。50,

5。00

l童mol・Lq磷蛋氨酸处理4她磊,DUl45缁稳

图4不阊剂量的硒蛋氨酸处理Dul45细胞48h藤,免疫细胞化学按术检测激瀵酶Caspase3釜篷褒迭愦流

Fig。4

DUl45cellstreatedwithdifferentdosesof

selenomethionineafter48h。

immunocytochemistry

theexpressionofactivecaspase3detectedwith

讨论

蓑重要的律恳研究表赣,硒对黪密骞黎好麓菝陡帮

治疗作用,关于磷仡合物的抑癌机制,目前主要有以下4秭:1)含硒纯合物W降低化学致瘸物菔与DNA

的共价结合,防止癌癍的发生;2)含磁化食物对某

硒与人体憋生理功能密切裰美,其参与体随多

种生物酶的合成,对细胞的生长、繁殖和生理功熊越

万方数据 

第6期藏艳渡,等:舔援氮酸对入前列豫癣DUl45绣艴瓒殪与凋亡盼影#惫

517

些癌缨胞有特殊浆杀伤作用;3)当体内缨胞长时阀暴露予过多的氧化压力肘,纲胞会进入一种遗传不稳定状态,导致癌症的发生,而硒元素能参与并促进体内多种抗氧化酶的合成(如谷胱甘肽氧化还原酶、硫氧还原蛋白还原酶),缓解氧化压力,预防癣症的发生;4)含硒化合物可凋整和激活身体的免疫功能,从丽间接地抑制肿瘤的生长¨剖。

凋亡异常与肿瘤的发生、发展有着极其密切的关系,这也是近年来肿瘤防治领域的研究热点之一.细胞弼亡调控失效,会引起细胞过渡增殖或蠲亡减少,从而导致肿瘤韵发生。缨胞增殖与凋亡失败决定肿瘤的增长速度,其中比较重要的是细胞周期的调控,细胞被阻止在Gl/S期问J.目前已发现硒能触发细胞弼亡,不需要抑癌基因p53参与,其机制是诱导细脆循环蛋自的改变,阻止缎施瑙期G,/S向前继续分裂,使DNA合成下降,硒一甲基硒代半胱氨酸导致

细胞循环蔹白激酶edk2活性降低,使细胞分化不能通过S期,从而致使细胞生长受抑¨引.

本研究采用醑汀法观察硒鬣氨酸对DUl45细胞增殖盼影响,结果显示,硒蛋氨酸呈剂量依赖性抑铡DUl45细胞增殖;流式细胞仪检测发现硒蛋氨酸具有诱导DUl45细胞凋亡的能力,并且随着硒蛋氨酸作用浓度的升高,DUl45细胞发生凋亡的比率也随之增加;吖啶橙染色结果也显示,硒蛋氨酸诱导缅脆凋亡呈现翥j羹依赖性,结果表明,硒蛋氨酸既可抑制DUl45纽胞增殖又可诱导其凋亡.

已知easpase家族是细胞凋亡发生核调控的重要因素,caspase8在细胞的凋亡中发挥启动作用,caspase3为最蓬要的凋亡执行分子.各caspase阎可裙嚣激活,进丽激发下一步的级联反应,导致缨

胞凋亡【1¨.本研究免疫细胞化学染色结果,对照组

DUl45细胞只有少量激活的caspase3的表达,而硒蛋氨酸可上调激活的caspase3表达.其机制可能为

硒蛋氨酸激活了细胞内的凋亡信号通路中的

easpase3,因隽半胱氨酸蛋盘酶上有与锌结合的半胱氨酸活性位点,硒蛋氮酸与锌有较高的亲和力,

从而使之与锌结合的caspase释放,进而激活凋亡特异性核酸酶,降解细胞骨架蛋白H玉聆j,使DUl45细胞凋亡,至于硒蛋氨酸诱导DUl45凋亡的信号转导通路尚需进一步探讨。

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【责任编辑:置坤】

硒蛋氨酸对人前列腺癌DU145细胞增殖与凋亡的影响

作者:作者单位:

刘艳波, 芦丽莉, 葛贺, 赵丽娟, 董妍, 赵雪俭, LIU Yan-bo, LU Lili, GE He, ZHAO Li-juan, DONG Yan, ZHAO Xue-jian

刘艳波,LIU Yan-bo(北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013;吉林大学,基础医学院,吉林,长春,130021), 芦丽莉,葛贺,LU Lili,GE He(北华大学,基础医学院,吉林,吉林,132013), 赵丽娟,赵雪俭,ZHAO Li-juan,ZHAO Xue-jian(吉林大学,基础医学院,吉林,长春

,130021) , 董妍,DONG Yan(美国杜兰大学,Roswell,Park,癌化学防治教研室,美国,布法罗,100029)

北华大学学报(自然科学版)

JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)2008,9(6)

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  • 现代医学对恶性肿瘤转移相关机制的研究进展
    [摘要] 恶性肿瘤转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段,是恶性肿瘤患者死亡的首要原因,临床上,60%以上的恶性肿瘤患者在发现时已经转移.近年来,现代医学对恶性肿瘤转移的机制研究取得突破性进展,从单纯的"解剖和机械" ...
  • 钙离子代谢
    第二章 细胞 Ca 信号转导与疾病 第一节 正常细胞 Ca2+ 信号转导 一.胞浆 Ca2+ 激度升高的机制 二.胞浆 Ca2+ 浓度回复至静息水平的机制 第二节 Ca2+ 信号转导的发病学作用 一.细胞凋亡与 Ca2+信号转导 二.缺血. ...
  • 口腔生物学
    生态系(ecosystem ):生物之间,生物与其环境之间的相互关系称生态系. 生态学:(ecology) 研究生物与其环境的相互依赖和相互制约的科学为生态学. 中心原则:生态系建立的中心原则是生物体对其赖以生存环境的适应与改建. 生态连续 ...