氨基酸类物质的荧光光谱分析
zuozhe
一、 实验目的
(1)了解荧光分析法的基本原理。
(2)掌握Ls55型荧光分光光度计的构造、原理及基本操作。 (3)掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。
二、 实验原理
荧光物质分子吸收了特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽并能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振等诸多信息等优点，已成为一种重要的分析技术。但由于能够产生强荧光的物质相对较少，故其应用不太广泛。对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π键结构或具有刚性平面结构等特征。
氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。
三、 仪器与试剂
1. 仪器：Ls55型荧光分光光度计，10 mL带玻璃塞的比色管，移液管。
2. 试剂：2.0 g/L的苯丙氨酸溶液；0.001g/L的色氨酸溶液；0.04 g/L的酪氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；色氨酸待测样。
四、 操作步骤
1. 配制实验样品：
色氨酸标准溶液的配制：从1×10−3mg/mL色氨酸标准溶液中分别取1mL ，1.5mL ，2mL ，2.5mL ，3mL 的色氨酸标准溶液于10mL 比色管中，定容。 2. 仪器操作：
详见仪器使用说明
五、 实验及结果分析
1. 概述
除特殊说明外，本次实验中所用仪器参数设置如下：电压：自动；激发狭缝宽度：7.0nm ，发射狭缝宽度：4.0nm ，扫描速度：1200nm/min。色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的发射光谱测量时的激发波长分别为219nm ，200nm ，200nm 。
2. 发射光谱及吸收光谱的扫描和讨论
本次实验中，对于色氨酸，酪氨酸，及苯丙氨酸的激发光谱和发射光谱测试结果如图1。
图1. 色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸的激发光谱和发射光谱
为了便于比较三种物质的谱图差异，我们将上6张谱图放在同一坐标系下进行比较，如图2所示。对于三种氨基酸的结构，如图3所示。相比于苯丙氨酸，酪氨酸上苯环多了一个羟基取代基，导致酪氨酸的荧光强度要强于苯丙氨酸，但其对于其发射波长的影响不大。而色氨酸的R 基是一个吲哚环，由于吲哚的上N 原子的吸电子效应，使环上电子密度降低，导致其荧光强度弱于苯丙氨酸和酪氨酸，同时其荧光的发射波长变长。
图2. 色氨酸，酪氨酸，和苯丙氨酸的吸收光谱及发射光谱
O
H 2N
CH 2
OH
O
H 2N
2
OH
H 2N
O 2
OH
Tyr
3. 对色氨酸的定量分析
实验中测得的标准曲线
如图
4所示。
本次实验中，测得未知浓度的色氨酸样品的荧光强度为932.956，从而由工作曲线可以得出该样品的浓度为3.0141×10−4mg/mL。
Try
图3. 色氨酸，酪氨酸，和苯丙氨酸的结构式
Phe
六、 思考题
1. 本实验中定量测定的条件参数是如何选择的，为什么？
激发狭缝和发射狭缝的宽度，以荧光强度为准，调节两狭缝使荧光强度既不太弱，又不会超出仪器量程即可。测量电压除信号较弱外，使用自动即可。 2. 影响荧光特性的因素有哪些？请列举说明。
荧光物质的环境，如溶剂、温度、溶液PH 、杂质、激发光源等，实验时要实验参数要确定实验物质的最大发射波长和最大激发波长，且所选用的溶液要适当。待测物要及时测量
3. 根据常规的荧光法能够实现混合物中这三种氨基酸的分别测定吗？若能，请说明原
因；若不能，请提出可行的测定方案。
从本次实验所测得的发射光谱谱图来看，酪氨酸和苯丙氨酸的荧光发射峰重合，无法直接进行测定。建议采用其他方法（如GC ，LC 等）进行测量，方便省力。