姓名 ### 班级 生命基地班 学号 201000140### 同组者：#####
科目 细胞生物学实验 题目 小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察 组别 ###
小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察
【实验目的】
1. 掌握染色体的制备方法；
2. 观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征；
【实验原理】
A. 染色体
染色体是基因的载体。真核细
胞染色体的数目和结构是重要的
遗传指标之一。制备染色体标本无
疑是细胞学最基本的技术之一，优
良的染色体制片是进行染色体显
带、组型分析、原位杂交等的先决
条件。
染色体的制备在原则上可以
从所有发生有丝分裂的组织和细
胞悬浮液中得到。最常用的途径是
从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培
养的细胞中制备染色体。本实验采
用的方法是从小鼠的睾丸细胞中
获取。
染色体的形态结构在细胞增
殖周期中是不断地运动变化的，一图1染色体形态类型 般在有丝分裂中期，染色体的形态
最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。
染色体特征：
1. 数目（2n=？）
2. 长度（绝对长度、相对长度）
3. 着丝粒位置（M\SM\ST\T）
4. 随体与次溢痕的数目、大小和位置
5. 带型分析
B. 操作方法
小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可以）。利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但其基本程序是简便的。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂
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和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。
由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。
减数分裂是细胞分裂染色体数目减半时发生在性细胞的形成过程中。哺乳动物在性成熟以后，精巢内的性细胞总是在分批分期不断的成熟，因此，对哺乳动物的精巢进行一定的技术处理，随时都可以获得减数分裂过程中各个时期染色体的标本。
用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。
C. Giemsa 染色法
MGG 由May-Grunwald 染料和Giemsa 染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此MGG 染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。
染色结果：染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。
其优点：染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不退色。MGG 染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE 染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG 染色更有帮助。
【实验用品】
1. 材料：小白鼠。
2. 试剂：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨原液。
3. 器械：手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离心管、离心机、玻片(冰片) 、天平、试镜纸、吸水纸、、烧杯、水浴锅。
【操作步骤】
预处理→取睾丸→剪碎→离心→低渗→离心→固定→离心→固定→滴片→染色→观察
1．预处理：取雄性小鼠按每克体重注射4ug ，给小白鼠注射秋水仙素（抑制纺锤丝的形成，使染色体排列在赤道板上，便于观察，而不至于纺锤丝的牵引下移动向细胞两极），经14-16h 后，断头法杀死小鼠，去除睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl ）洗去血污；
2．放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）；
3．用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml ；
4．37℃静置30min ，进行低渗处理（不能使细胞因吸水而涨破）；
5．离心：800-1000r/min 离心8min （务必要控制在800-1000r/min，过大会使细胞涨破，导致实验失败，时间也要控制，过长也会影响观察）, 弃上清液；
6．加入2ml 甲醇冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散细胞，固定8min ；
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7．再以800-1000r/min 离心8min ；
8. 弃去上清液，加1ml 固定液，制成细胞悬液固定5min ；
9. 取清洁的低温预冷载片，距1.0-1.5m 高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻轻吹气并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促进染色体展开；
10. 用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥后染色20-30min(采用倒置染色法，目的在于可使载玻片充分接触染液，若有杂质也可沉降至底部，不会和玻片直接接触) ，用自来水冲洗后可观察；
11. 观察：先用低倍镜寻找细胞及中期分裂相，然后转入高倍镜下观察并记录。
【注意事项】
1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处；
2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上，低渗与离心等步骤的操作要轻；
3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象;
4. 细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上；
5. 染色体形态和分布良好，最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错；
6. 所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段（分裂中期），即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样，在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响观察和计数；
7. 固定液和Giemsa 染液须现配现用；
8. 低渗时间应掌握准确；
9. 低渗后的细胞吹打时动作要轻，离心速度不能高于1000 r/min。
【实验结果】
实验图示：
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【结果分析与讨论】
1. 在理想状态下，小鼠肝细胞质中的线粒体应该被染成蓝绿色，但是在实际观察中，线粒体呈浅绿色甚至无色。可能原因有：
a) 染色时间不够，使染色不够充分；
b) 肝组织块剪得太大太厚了，使得染料透过速度太慢，最终使得大部分的细胞未染上色； c) 根据实验原理要求，染色剂的浓度要求极稀。这本身就让染色过程具有了一定难度。
2. 在显微镜下观察时，可以看到红细胞数量远远多于线粒体的数量。出现这种情况可能是由于： a) 在处死小鼠时，放血不够充分，导致大量血液淤留在了肝脏中，使最终视野中红细胞过多； b) 取出肝组织块后，用Ringer 液未将血污冲洗干净，使其部分残留在肝组织块表面，并最终混在了细胞悬液内。
3. 本次实验使用小鼠肝细胞作为观察线粒体超活染色的材料，主要有以下几点原因： a) 线粒体含量较多，每个肝细胞有1000-2000个线粒体；
b) 长度适合观察，约5μm ；
c) 肝脏较软，易于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性；
d) 就以上某一条而言，均有其他部位可以替代肝脏，但若全面比较三个条件，则肝脏为最佳。