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结核病的分子生物学诊断技术研究进展

07/07

・综述与讲座・

结核病的分子生物学诊断技术研究进展

路超,刘义庆。壬长印。卢志明‘≤山东大学陡属痿蛊医院,济舞250021>

关键词:结核瘸;结核分支杆菌;分子生物学

中匪分类号:R52;R34

文献标志码:A

文章编号:1002-266X(201I)31-01124)3

近lO余年来,结核瘸发病呈全球持续恶诧,2007年死子结核病的患者约177万…。结核杆菌:魁结核病的主要皴病菌,可在人群中传播,对外界环境的抵抗力强,易产生耐翡

I'CR时一个纲魄中rRNA数豢燕DNA鹅100倍,因此扩蹭产物增多,试验的灵敏度大大提高。该法可用予结核病的诊

断,缺点是戈法区别死菌和活茵。巢式PCR、半巢式PER采

用内外两对弓l物,进行两次扩爆,内引物以外引物扩增产物势模叛送褥第二次扩堰。霹撼蹇裣瀑懿灵敏度,赛霹获陵床标本中壹按梭出结核分枝秆耱,能用于种属鉴别。单管平衡

菌株。传统的病原学检豢豫便易行,但特努性、灵敏度较差,

血清学等敏感性或特舅性不理慧。分子熊勃学诊凝技零燕

一种篱便、快速、灵敏、特异、试热稳定、荒危害性的结核病诊

断和分类鉴定方法,现对其研究进展综述如下。

半巢式PER可有效控制污染,提高扩增效率;单管巢式逆转

录PCR可Ⅸ分死菌与活菌。

络核杆菌的分子生物学特点

1998年英冒Sanger巾心和法国的Pasteur研究所合作并

2。1.2在PCR基础上发展的核酸扩增技术①PER・单链攘象多态性分辑(FCR-SSCP)。楚检爨荤璇基突交霹靠夏筵便的方法。PER产物为两条置率}单链,各单链孵藏基序列不

同可形成不同的空间构象,在凝胶上显示不同的带型,可确定有无突囊。目前采用PcR—SSCP技术分析耐多药结核杆蓥的耐药极联已成为研究热点,尤其是该法壹接梭测噬,寒标本孛绪孩轩装辩药基医戆残功,将会对簧统结援麓敏试验产生新的挑战。Sheen等p’学者梭测比嗪酰胺的黼药基因,与

震了结棱分菝耪蓥H37Rv株戆全基因缝嚣彦王捧拉j,迸察

结核杆菌全基因组由4

411529

bp组成,富含许多重复序

列,尤其是插入序列,亦包括新的基因家族和管家基因。C,C碱基禽量高达65.6%。宥约3924个开放阅读框,其中约40%有功能,44%可熊翁功憝,16%称为孤独痔列。闻隧予是断缀蒸透孛所箕有的嚣编码痔襄,结谈分棱抒善的颞蠢耋复序梦lj被菲重复的独特间隔子(长度34—4lbp)分隔。生要的多态串联重复是结核分枝杆菌染色体中一种主要类型的重复DNA,由10bp的短串联重复序列被5bp的间隔子分

其他四种技术相比,PER-SSCP技术快速、高效、价格低廉,对指导临床治疗及用药有一定应用价值。另有攀者用PER—

SSCP技术检测了22株il|}多药的结核药菌株katG、rpoB、疆逋

隰缓成。重组霞粒PTBNl2翘含毒一令3。霹晒鳇播入序懿。

2001年Fleischmann等狰’对结核耪菌C聪1551全基医组进

行测序工作,并与H37Rv株的序列进行比较,得出基因多样

性在结核病发生、发展中扮演重要角色的绪论。2络核病的分子生物学诊断技术

2。l孩酸扩增技本PCR技拳及其他倦羚核酸扩增技零嶷

基嚣突变,分疑检鑫突变基送16株、19株、14撩,但该法苓

能确定突变部位和性质,对操作技术要求过高,影响因素较

多,目前只猩条件较好的实验窒开展研究。②序列特异引物一多聚酶链反应(ecR-ssP)。PcR—SSP的引物是根据不露类型核・螽枣列关键尼姓碱麓貔差异两设计,产携经电泳分离,堇理为不两约酚梯状扩增片段图谱。鬟褥爵学者M6ndez等№1首次用PER-SSP技术检测结核病患者KIR基因

结狻瘸领域的应用,为缀核病的诊断耧鉴别诊断拜辟了新途

径。

2.1.1单纯PCR技术①经典的PcR技术。选用一对特

异性孽l物进行扩增,遴过检测扩增后的髓的片段来鉴别缨蓥。麓蠢法一般仗麓将缨蓑鉴别蓟震或粪,对静静鏊到意义不大。Elbir等¨1报道了一种简单、快速、敏感的菌落PcR技术,不需抽提结核分枝杆菌的DNA,直接襁反应混合物中加入乙醇,可于2h内有效杀死结核分枝杆越,其认为该法可

多态性,简单、快速。③PEa与核酸探针技术的结合。当靶基因存在时,产生荧光,荧光的强度与PER产物蟹星正比,可定量测宠。实时荧毙定量PER具有季l耪穆探镑静双重特性,可提高掰的基因梭瀑的特舅性。P妇匆等挣。耀了一种稳定、快速、两步多重实时PER技术,在60个临床样品中,检

测到3例为卡介苗,57例为结核分枝杆菌,可用乎常规临床实验室。另翁学者奔绍了一种宽范围定量的巢氏Real-TimePCR检测络拨分棱耔蓥的方法,其有较裹豹准确臻褰较广鲮

簿化诊断步骤,降低操作者潜在感染几率。②菲经典的PER

芨零。寇箍遂转录PER及纂式Pc襄、拳巢式PER。逆转荣

基金项目:山东省科技攻美计划项目(2009C910002014)。

‘通讯作者112

检测范黉。另外,分子灯搭技零亦适合予检测点突变。Go-Ⅱ蚍等蹲1为了增加其临床应用价值,建立了一个客观的检测

rpoB突变的分子信标qpER方法,敏感度和特弊性均提高。

万方数据

④限制性片段长度多态性及限制性内切酶分析。是以PER

为基础的分类鉴定技术和限制性内切酶分析相结合的技术。扩增产物经限制性内切酶消化,不同分枝杆菌电泳图谱呈现多态性。Caws等检测了耐异烟肼的KatG-315突变基因,与

传统药敏试验相比,其敏感性提高到∞%,而特异性可达

100%。有研究通过对65kD蛋白基因的PCR产物进行限制性酶切分析,准确检测出结核杆菌的属内归属。限制性片段长度多态性及限制性内切酶分析法是鉴定分枝杆菌种的可

靠程序,较形态学和生理、生化特征等常规方法更准确、快速。⑤PcR-基因缺失分析。分析结核分枝杆菌H37Rv全基

因组序列后发现,有16个区域(RDl.RDl6)在结核分枝杆菌

成员中缺失存在差异。因此,应用PER技术探查基因组特

异的区域是否存在,通过特定的缺失图谱可区别各成员。Pounder等p1应用PCR基因缺失—解链温度分析结核分枝杆菌的不同成员,准确率为94%。该方法最突出的优点是可简单快速地鉴别MTC成员。⑥随机扩增多态性DNA。原理是用一条人工合成寡核苷酸引物对整个DNA链进行探查,在较低温度下与匹配或部分匹配的退火位点结合,扩增出呈现多态的DNA片段,经电泳后可得到DNA指纹图谱,从而进行菌种鉴定。Esteban等检测鉴定了戈登分支杆菌,此方法对标本要求不高,简单快速,成本较低,且又无需预知

靶DNA序列。⑦逆转录—环介导等温扩增一酶联免疫法

(RT-LAMP-ELISA—hybridization)。由Lee等¨刚发明的一种新技术,用于快速检测结核分枝杆菌的16SrRNA,检测灵敏

度为94.1%,高效、低价,有望用于常规临床检测。⑧异源双链分析。是将含有突变基因和同段无突变基因PER扩增

产物混合,加热变性后再复性,若待测基因有突变,则在复性过程中可形成部分来源于突变与无突变基因的异源双链,同时亦形成部分同源双链。根据电泳迁移率的差别判断有无基因突变。

2.2

DNA探针技术核酸探针是指用放射性或非放射性

物质标记已知DNA或RNA片段,检测样品中未知的核苷酸序列,经显影、显色或荧光检测的方法,将结合核苷酸的位置或大小显示出来。迄今为止,用于结核杆菌快速检测和鉴定的探针有cDNA探针、全染色体核酸探针、寡核苷酸探针、克隆核酸探针和DNA片段探针等,检测方法有膜斑点杂交、原位杂交、印迹杂交和液相杂交等。核酸探针技术的显著特点是高度特异性,可用于结核病的诊断、菌种鉴定和耐药性检测等方面,使用最广泛的是反向斑点杂交技术及反向线点杂交技术。有学者鉴定了15种临床上常见的分枝杆菌,与传统的生化试验和测序相比敏感性和特异性均为100%。基因芯片基于反向杂交技术,将大量靶基因探针高密度排列固定于一块特殊处理的载体上,标记的PCR产物与载体上的探针进行杂交,以特定仪器检测杂交信号而对细菌进行鉴定oSanguinetti等uu用此技术进行检测,需样本少、准确、信噪比极小且易于操作,开辟了新的临床诊断视野。由于芯片制备较复杂,检测成本高,临床实验室很难推广使用。WHO推出了一种线性探针检测法,由德国一家企业开发。可直接用患者的唾液来判断其中的结核菌是否对两种常用药物具

万方数据

有抗药性,便于医生快速做出诊断。

2.3指纹图谱技术在结核分枝杆菌染色体DNA中选择

合适的重复序列作为遗传标志,建立DNA指纹图谱技术,可

检测出流行病学上无关菌株的DNA多态性。用限制性内切酶消化结核分枝杆菌染色体DNA上特定的核苷酸序列,电泳分离后,将片段转移至膜上,与带标记的DNA探针杂交,检测出与探针同源的限制性片段,其片段的数目和大小的变化使每株分离株呈特征性带型。PER双脱氧指纹图谱是由PcR.SSCP和双脱氧DNA测序结合产生的一种方法,主要用于结核菌耐药型测定。

2.4

DNA测序技术包括双脱氧链终止法、化学降解法、

PER测序法及DNA测序仪的应用。焦磷酸测序法准确性更

优于传统测定法,是检测分枝杆菌特异性核苷酸序列最直接可靠的方法,已成为菌种鉴定的“金标准”。Bao等¨21学者对焦磷酸测序法及常规分型法、SANGEB法进行比较发现,焦磷酸测序法鉴别抗酸杆菌的准确率为98%。目前,DNA序列测定不仅可鉴别应用生化试验难以鉴别的菌种,而且可鉴定某些少见的或需特殊营养成分的分支杆菌菌种,不仅能用于基因突变的检测,且能确定突变的性质与部位。Che

等¨31用序列分析法检测了与结核相关的IRGM基因多态

性,结果在其启动子区域发现29个多态性位点。

2.5高效液相色谱技术根据离子对反相高效液相色谱技术的原理,通过DNA分离柱,对核酸片段进行分离和分析。一些学者采用此技术对抗结核药物耐药性相关基因突变进

行筛选的结果再次肯定高效液相色谱技术用于分枝杆菌鉴

定的可行性。通过研究耐药基因的突变点,结合序列分析,成为简单高效快速的检测结核病耐药基因较实用的方法。变性高效液相色谱技术是一种新的基因检测技术,在分枝杆菌基因分型鉴定及耐药基因检测方面均有较大应用价值。

随着分子生物学技术和交叉学科的发展,目前临床实用而颇具开发价值的反向杂交技术已显示出极大优势,适合在地区级分枝杆菌实验室开展。DNA测序是公认的鉴定菌种和检测耐药基因突变的“金标准”,随着测序仪不断改进,其应用可望普及。此外,液相芯片技术亦具有良好应用前景。结核病分子生物学的研究在不同领域已取得较大进展,随着各种技术不断完善与发展,分子生物学将为结核病的诊断、治疗、流行病学调查等提供更大帮助。参考文献:[1]Gl,%iou

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a遮Ch自藩Acta。20lO,411(21-22):1645-1649。

《羧羲Ft期:2011-04-21)

・经验交流・

静脉应用放射性药物应注意的问题

刘慧琦

(艘截汝霹中心医院幽东东营257034)

放射性药物是临床影像学检查的常用药物。实际工作中保证放射性药物准确注入体内是显像成功的关键。我们

体会临藤应用中应注意以下阕题。

射量型号的注射器。为避免注射后注射器内药物残留及内

壁沾染,抽吸究治疗量药液后应吸人相当于死腔残余量的气

棼(用5d注射器接吸药液时瓤在吸入需要量药液蜃暖人

0。2

基本要求:①注射时严防针夹脱壅盎管;②行垒身曹显像时,取正常侧手臂注射;③体内法标记红细胞进行心血池显像时应预先注射焦磷酸娥,再注射孵mTe,采用两个不同部位注射;④下肢深静脉造影时,注药及显像过程中要保证扎蘩跺郝业鹿带;⑤酶止浅静脉显影;⑥。弹丸”式注射对严格执行狻零操作规程,动彳#邈速协调;。弹丸”傣积应<ld,淡

《O.5

ml气捧)。海避免注射器凌药爨翡辐袈箨糟,掰采震头

皮针注射法:第1次,用5血注射器抽取3—5越生理盐水,接一次性静脉注射针穿刺后注入2ml左右生理盐水;第2

次,迅速从携繁式防护箱中取出抽有放射性药物的注射器,

搂蓊脉注射铮浓入药耪;第3次接装鸯生理盐承的注射器,

注入垒理盐水。其优点鸯可避免药物渗满,减少注射器审药物残留量、减少辐射量,尤适用乎年老体弱和多次化疗后表浅静脉穿刺难度大者。其不足光处为将抽有放射性药物的注射器与静脉注射针对接时易数药物泄漏,增加空气与放射

mi为宜。

静脉选择:核素检查者中老年肿瘤患者较多,因其表浅

静脉均凌不同程度的结构改变,血管壁脆性增加,弹性降低,

静辣缎玻宠叠差,蛊管荔移凑等,壹接注射鬻缕泼一次成功;

毪药势接魅搬会颡时阕;揉俸攘黪复杂。毒学者设诗了敌炎壹接注射法:鄹静脉穿刺觅隧巍注入药液,注射籍攘回盘ld,再次注射。以冲洗残留药物。其优点为注射器内显像剂残留活度明摄低于传统直接注射法;注射剂量准确;但不能扶根本上提赢一次穿刺成功辜。岛头皮针相比,静脉窝置针具有较多优煮,磐赛终篱鼙、整攫方便,对耋管刺激健夺,恚

者痛苦小,髓时保持静脉通道的邋畅,杜绝注射器与头皮针对接导致的泄漏。近年来电机驱动的核素注射器用于临床其可解决弹丸滤射造影剂“拖尾”现象;图像采集糟可统一控镪核素造影荆接注秘影像采集,避免因注射与采集不同步

再次注射将延长工作人员接受射线照射时阀及增掘患者痛

苦。静脉注射操作时宜选择粗、直,富有弹性,无静脉瓣,血流量丰富,易于固定的静脉;同时避免靠近神经、韧带、关节的手臂、腕蠢孽重_窝静脉。选择避开患侧肢体,且穿刺方便的震嚣黪躲。穿枣《部位应焉感染、瘢疫等。上歉头静稼、责要

静脉为常用静脉。。弹丸”妓注射对注射意为颈静脉或左肘

静脉,因这些部位静脉分X较少,又距心脏较近,。弹丸”不易破碎。

注射器具及注射方式:辑究发理,注射麓注射器内及针夹残余嚣薰、注射嚣配药蘑黏酣量、粉蠲药物繇巽后增容堂

导致豹部分漾注霉豫丢失瑗象,券冒藏步操作过程审豹射线

危害。

(收稿日期:2010.06416)

等对药物注入剂量有一定影响<1、5、20ml浅射器的无效臆

量分别为44.5、117、131“),故临床应用中廒避免使用超注

114

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