・392・药学学报ActaPharmaceuticaSinica2007,42(4):392-
395
金刚烷胺衍生物的合成和生物活性
李艳萍,李卓荣,曹 珏,陶玉杰
(中国医学科学院、中国协和医科大学医药生物技术研究所,北京100050)
3
摘要:为了寻找新的神经元保护剂,合成了7个新的1位氮取代的金刚烷胺类衍生物,其结构均经核磁共振氢谱(1HNMR)、MS2FAB和高分辨质谱(HRMS)确证;以四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定法初步考察了所合成化合物体外对谷氨酸损伤神经细胞的保护作用,研究显示,500μmol・L-1谷氨酸能够引起神经元细胞发生明显的损伤性变化,细胞死亡率升高,MTT值明显降低,LDH;能够显著提高谷氨酸损伤的人神经母细胞瘤株SY5Y的MTT代谢率,,3d和4c能显著降低LDH漏出率,关键词:金刚烷胺;美金刚胺;衍生物;谷氨酸
中图分类号:R916.2 文献标识码:A:-4870(2007)04-0392-04
veactivityincellcultureofaminoadamantaneanalogues
LIYan2ping,LIZhuo2rong,CAOJue,TAOYu2jie
(InstituteofMedicinalandBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalScienceandPekingUnionMedicalCollege,
Beijing100050,China)
3
Abstract:Sevennovelderivativesofaminoadamantanewith12aminosubstitutedgroupweresynthesizedfromamantadineormemantineindividuallyinordertofindnewneuroprotectiveagent.Sixofthemareamidesoftwoprecursors,oneisa12aminoderivativeofmemantinesubstitutedwith22hydroxy
1
propyl.TheirchemicalstructureswereconfirmedbyHNMRandHRMS.Theneuroprotectiveactivityin
-1
vitrowasevaluatedprimarilywith500μmol・LglutamatedamagedSY5YcellbymeasurementofMTTmetabolicrateandLDHleakagerate.GlutamatereducedMTTmetabolicrate,butincreasedLDHleakageratesignificantly.TheadditionofnewderivativeselevatedtheMTTvaluewiththeircertainconcentration,reducedcelldeathrate.Especiallyasfor3dand4c,theyfullynormalizedLDHleakageratewith
-1
concentrationof20μmol・LduringLDHmeasurement.Thesedataindicatedthat3dand4chavesignificantprotectiveeffectonnervecellagainstglutamateinjury,deservedtobefurthertestedandmaybehelpfulfortreatmentofneurodegenerativedisease.
Keywords:amantadine;memantine;derivative;glutamate
随着世界人口老龄化,针对衰老和老年人认知功能障碍的研究已经成为当今神经科学领域的重要
[1,2]
内容。老年人认知功能障碍以阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)最为多见。AD是一种常见的中枢神经系统进行性变性疾病,其主要症状呈
收稿日期:2006207214.
3
通讯作者 Tel/Fax:86-10-63027185,
E2mail:l-z-r@263.net
慢性、进行性加重态势,尚无有效的治疗方法,一般
在7～8年后多数患者的生活变得严重受限甚至不能自理,给家庭和社会带来沉重负担,已经成为影响世界各国发展的一个重要因素。AD带给社会的经济负担将不容忽视,尤其是对于老年人口绝对值较大的中国,AD引发的社会问题更是亟待解决。美金刚胺(12amino23,52dimethyl2adamantane,memantine)是作为N2甲基2D2天冬氨酸盐(N2methyl2D2aspartate,
李艳萍等:
金刚烷胺衍生物的合成和生物活性・393・
NMDA)受体拮抗剂用于AD治疗的代表药物,已于2001被FDA批准上市,用于重度AD及血管性痴呆
的治疗。而且也有研究表明,NMDA受体的拮抗剂还对神经组织的肿瘤生长有抑制作用,如神经细胞瘤和神经胶质瘤。而经典的抗病毒药物金刚烷[4]
胺(12amino2adamantane,amantadine)与前者的结构差别仅在于3,5位上没有甲基取代,并且也具有与memantine近似的NMDA受体拮抗作用,同时它还具有增强多巴胺能神经传导和抗谷氨酸的活性。但是实验证明它在脑内的浓度远低于
[5]
memantine,而且复杂不清的作用机制也使其没能成为AD治疗药物。
金刚烷胺类化合物结构简单、稳定性好,本研究分别以美金刚胺(1)和金刚烷胺(2)为先导物,合成了3种共6个在二者1[6,7]
物,参考Gmiro等研究报道,1位(1),旨在通过对1活性的影响
。
[3]
谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质,在AD及脑缺血、缺氧性损伤等许多神经系统疾病中均表现为内源性兴奋性毒素作用,它通过与NMDA,AMPA等受体结合,影响神经元的应答反应,对神经元产生明显的损伤作用。文献报道
-1
500μmol・L的谷氨酸对SY5Y细胞的损伤模型是比较适合用于体外评价药物对神经细胞的保护作
[9]
用。本文通过MTT法和测定细胞LDH漏出率对所合成的化合物进行了体外受谷氨酸损伤的SY5Y(图1,2),同时用2:(1)
-1
μLMTT代,,,并且所产;(2)细胞受到谷氨,各化合物均能在某一或某些给药浓度条件下使吸收度值明显高于谷氨酸组,两者相比有显著性差异,而与对照组相比无显著差异;细胞死亡率得到明显降低。(3)
-1
化合物3c和4c在5～60μmol・L的给药范围内均能显著地增加MTT试验中光吸收度的作用。(4)
-1
试验样品浓度为20μmol・L的3c,4c和3d在以2个先导物作为对照的LDH漏出率试验显示,
与谷
[8]
r1:N(Et)3,CH2Cl2,0℃,4h;r2:THF,rt,overnight
Scheme1 Syntheticrouteofthecompounds3a-3d,4a-4c
所选择的合成方法简单易行,收率稳定。在合成化合物3d的过程中,虽然环氧丙烷与1的摩尔比远远高于1∶1,却只得到单取代衍生物。且主要得到胺基进攻环氧乙烷位阻较小的3位碳生成的产物3d。环氧丙烷及1均为液体且可互溶,因此反应也
可采用密闭条件下不加反应溶剂四氢呋喃而直接进行。由于所采用的环氧丙烷是消旋体,得到的产物也无光学活性。
本文合成得到的7个目标化合物均未见文献报道,其结构经HNMR和HRMS确证。理化数据和波谱数据见表1。
1
Figure1 Influenceofcompoundswithdifferent
concentrationsontheviabilityofSY5YinMTTassay.Avalueratiovscontrolgroups
・394・药学学报ActaPharmaceuticaSinica2007,42(4):392-
395
Table1 Structures,physicalpropertiesandexperimentaldataoftitlecompounds
Compd.3a
M.F.C14H23NO2
MS2FAB(m/z)237[M]+
HRMSCalcd.(Found)2371172879(2371171329)
3b
C16H27NO2
265[M]
+
1
HNMR(CDCl3)δ
AppearanceWhitesolid
mp/℃45-46
0182(s,6H),1107(s,2H),112-115(q,J=12Hz,612Hz,4H),116(s,4H),1175(d,J=214Hz,2H),211(t,1H,J=313),316(s,3H),4158(br,1H)019(s,6H),111(s,2H),112(d,6H,J=613),1122-114(q,4H,J=12Hz,613Hz),116(s,4H),1185(d,2H,J=3),2115(t,1H,J=3),415(Br,1H),4178-4185(m,1H)
2651204179(2651202003)
Colorlessoil
3cC22H33NO3359[M]+3591246044(3591243881)
0182(s,6H),019(s,3H),111(s,6H),1118(d,2H,J=415Hz),112-114(q,4H,J=12Hz,613Hz),1158-117(m,2H,J=412Hz),1163(s,4H),118(d,2H,=3Hz),1183-1195(m,2H,J415Hz),1(J=3Hz),612(br,)
Whitepowder118-120
3dC15H27NO
238[M+1]
+
2381217090(2381217731)
018(s,6H),110(d,61)105(J=614Hz),(2),1122(s,4H),4(J=1)2105(t,1H,J=312Hz),2136J6Hz),313(br,1H),315(q,1H,J=6),413(br,1H)
Yellowoil
4a4b
C12H19NO2C14H23NO2
]
1141(1140270)2371172879(2371171448)
1153(t,6H,J=3Hz),119(d,6H,J=214Hz),211(s,3H),316(s,3H),415(br,1H)
112(d,6H,J=511Hz),116(t,6H,J=3Hz),119(d,6H,J=214Hz),2109(s,3H),414(br,1H),4183(s,1H)
019(s,3H),111(s,6H),1156-117(m,2H,J=418Hz),117(s,6H),1185-1194(m,2H,J=415Hz,910Hz),210(s,6H),211(m,3H),611(s,1H)
WhitepowderWhitepowder
112-115115-117
]+
4cC20H29NO2
331[M]
+
3311214744(3311214882)
Whitepowder180-181
HRMSionsourcewasEIexceptthatcompound3dtestedwithFAB
氨酸组相比,化合物4c和3d组均显著减少了神经细胞LDH漏出;而且化合物3d和4c的作用与对照药美金刚胺相当,具有显著性差异,对谷氨酸损伤神经细胞体外模型显示了保护作用
。
谱用VarianMercury2300MHz核磁共振仪测定(内标:TMS);酶标仪型号为DiagnosticPasteurLP400。美金刚胺为本室合成,金刚烷胺及樟脑酰氯从百灵威公司购入,甲氧酰氯、异丙氧酰氯及其余试剂均为北京化学试剂公司产品,未经注明均为化学纯。细胞试验所采用的SY5Y细胞株由瑞典卡罗琳斯卡研究所提供。MEM培养基为GibcoBRL,415002034产品;谷氨酸(L2glutamicacid)及32(4,52dimethylthiazol222yl)22,52diphenyl22H2tetrazoliumbromide(MTT)为Sigma产品;乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒为北京化工厂产品;HEPES从DNNCompany购得,胎牛血清从Sigma购得。1 化合物3a的制备
将三乙胺(0124mL,117mmol)加入1(300mg,1167mmol)的THF溶液中,搅拌10min后,冰水浴及N2保护下,向混合液中滴加氯甲酸甲酯(1167mmol),室温搅拌3h。过滤反应液,THF冲洗不溶物,合并滤液,蒸除溶剂,残留物用硅胶柱分离纯化,洗脱剂(环己烷2乙酸乙酯25∶1)冲洗,收集洗脱液
Figure2 LeakegeLDHactivity.P
33
controlgroup;P
3
实验部分
熔点用X6型熔点仪测定,温度计未校正;质谱用AutospeeUltima2Tof型质谱仪测定;核磁共振氢
李艳萍等:
金刚烷胺衍生物的合成和生物活性・395・
浓缩后得到目标物0137g,收率为86%。
同法分别采用氯甲酸异丙脂或樟脑酰氯为试剂,制备得到化合物3b和3c,收率分别为84%和93%。
以金刚烷胺(2)为原料,同法分别合成得到4a,4b和4c,收率分别为91%,85%和90%。2 化合物3d的制备
法),测定450nm处吸收度,计算乳酸脱氢酶活力,
并用SPSS软件作统计分析。
致谢:体外神经细胞保护活性由首都医科大学宣武医院神经生化室完成;中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所代测核磁共振氢谱和高分辨质谱。
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attenuatesstaurosporine2inducedactivationofcaspase23andLDHreleaseinmouseprimaryneuronalcultures[J].BrainRes,2006,1069:145-153.
-1
向1(350mg,1195mmol)的THF溶液中加入
1,22环氧丙烷(230mg,410mmol),搅拌均匀后,室温密闭搅拌,TLC跟踪反应,每隔4h加入环氧丙烷(0111g,1195mmol)至原料消失。减压蒸干反应液,残余物加入氯仿溶解,依次用氢氧化钠、水、硫酸钠水溶液洗涤,有机层经硫酸镁干燥后蒸除溶剂,残留物用硅胶柱分离纯化得到3d0131g,收率为67%。
3 3.1 细胞培养 培养于MEM培养基中,、15mmol・LHEPES、青霉素100・mL、链霉素100u・mL
-1
-1
,
于5%CO2,37℃每周换液2次,传代1次。3.2 MTT法测定神经细胞存活率 将SY5Y细胞
3
以每毫升1×10个细胞接种于96孔板(Costar产品),3d后分为正常对照组、谷氨酸(50μmol・-1-1
L)损伤组和谷氨酸(500μmol・L)加浓度分别
-1
为5,10,20,30,40,50和60μmol・L各化合物组,
-1
每组8孔。接种后4d每孔加MTT(5g・L)20μL,37℃孵育4h,吸出培养液,每孔加DMSO200μL,振摇10min,用酶标仪测定550nm处吸收度,并用SPSS软件作统计分析。
3.3 化合物对SY5Y细胞LDH漏出率的影响 将SY5Y细胞以每毫升1×10个细胞接种于24孔板,3d后分组同MTT法,每组8孔,接种后4d留取各
3
组细胞培养液,LDH测定试剂盒所示方法(比色