中国
乳品工业
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保加利亚乳杆菌浓缩培养的研究
黄良昌，吕晓玲，姚秀玲，朱惠丽
(天津轻工业学院食品科学与生物工程学院，天津#""!!!,
摘
要：对培养保加利亚乳杆菌的基础培养基进行筛选，确定为-./培养基。然后优化培养条件：发酵时间为$!0，起
始12值为+34"，发酵温度为%"5。最佳培养基6-./培养基7*3+8番茄汁7$!8麦芽汁7"3"")9:;?>;!7!8乳清。通过中和试验，保加利亚乳杆菌菌体浓度可达到)3++@$")9=’$。
关键词：保加利亚乳杆菌；-./培养基；中和试验中图分类号：A/!+!3$
文献标识码：B
文章编号：$""$’!!#"(!""!,"$’""$!’"%
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会造成对菌体的一定损害，降低发酵剂保存期内的存活率，因而本法目前生产上应用较少。"化学中和法—利用中和剂控制培养过程的12值，以解除乳酸对菌体生长的抑制作用。#缓冲盐法，这种方法的原理与化学中和法类似。$渗析法(也称过滤培养法,—这种方法利用膜技术，选择适宜的膜孔径来浓缩菌体，用此法达到的菌体浓度比上述#种方法都要高(大于$"$$9=’$,b!c。在国内，有人利用中空纤维对乳杆菌进行了渗析培养。这种培养方法尽管达到了较高的菌体浓度，但多次过滤耗能大。对超滤膜材料的要求比较严格，另外在培养过程中易感染噬菌体，此法应用并不广泛。
本文首先找到适合保加利亚乳杆菌生长的基础培养基，确定其最佳的培养条件。在众多营养物质中找到合适的增强因子对培养基进行强化，得到优化培养基，然后通过流加碱中和实验，使培养液保加利亚乳杆菌的浓度接近$"$"9=’$，一方面可直接供给中小型乳制品厂直接使用；另一方面也可为干酸奶发酵剂的制备提供基础发酵液。
"引言
世界上制做酸奶已有悠久的历史。古代希腊、印度、埃及人就已知道酸奶的制做方法。本世纪初，诺贝尔奖金获得者—俄国著名的科学家梅奇尼科夫提出了经常饮用酸奶可以长寿的“酸奶长寿说”。此后，酸奶的名声大振，世界年生产量和消费量大增，各国学者进行了深入的研究，相继做出了具有各自特色的酸奶和其他类型的发酵乳，指出发酵乳的保健、长寿和美容等功效，从而进一步推动了发酵乳制品的发展。
在酸奶的制做过程中，发酵剂的选择极为重要。发酵剂是发酵乳制品制做过程中所必需的微生物制剂，直接影响生产工艺过程及质量控制。它的制做过程工艺技术要求高、难度大。制备干酸奶发酵剂，首先要对乳酸菌进行高浓度培养，这是干剂制备的关键。目前国内外大致采用如下几种培养方法b$c：!物理法—通过将常规传统方法制得的液体发酵剂进行离心分离，使菌体得到浓缩。采用本法
收稿日期：!""$’$"’!!
作者简介：黄良昌($)*+’,，男，硕士，从事食品添加剂与发酵乳制
品方面的研究。
$材料与方法
菌种：保加利亚乳杆菌(!"#$%&"#’(()*&)(+",’-
$!
总第$%&期）!""!年第#"卷第$期（
研究报告
!"#，1320，由本院微生物实验室提供。
主要原料：脱脂奶粉+简称)450、乳清。酸度+滴定法06"7：以吉尔涅尔度+890表示。:;值的测定：采用’3’!级便携式酸度计及精密:;试纸。
乳酸菌活菌计数6.7：用血球计数板显微计数法和采用5?4!!@，!AB"0
C?值的测量6D7：采用#>=E@**’型可见分光光度计测定，波长/D’FG。
*
*3!
结果与讨论
基础培养基的选择
基础培养基的选择应基于价格低、细胞产率
图*）1&2菌的生长曲线（"
由图!和图*可以看出，保加利亚乳杆菌从一开始菌数急增，经过较短的延迟期后即进入对数生长期，AJ达到高峰，以后则进入生长稳定期，此后菌数基本不再增加，并稍有下降，至*!J下降的速度更快，进入衰亡期。C?值从一开始急增，到!*J后达到高峰即基本保持不变，表明此后菌数不再增加，但与菌落对数曲线相比有一段差距，说明此后有一部分菌被自身所产生的代谢产物抑制甚至杀死了。酸度则一直随着时间的延长而升高，证明乳酸的浓度随着菌株的生长一直在升高，又因为乳酸对菌的生长的抑制作用，因而阻碍了菌的进一步生长繁殖。:;值则在!*J以前下降较快，说明在对数生长期，菌的生长代谢速度也比较快，以后则下降缓慢，最后基本维持不变，说明132菌开始生长繁殖
高、存活率高、容易收获和保持混合菌菌相平衡条件，通常使用脱脂乳和乳清6/7。表!为选择的/种培养基做比较实验。
从表!可以看出，单从增菌效果来说，以乳清H/I脱脂奶粉的乳清培养基最好，但考虑到喷雾干燥时不易进行菌体的分离浓缩。因此，选择改良5
132菌生长曲线的测定
为了解132菌在改良5
较快，进入衰亡期后，菌数越来越少，产酸量也越来越少，:;值曲线渐趋平衡。
这种环境意味着!*J以后已经明显不利于保加利亚乳杆菌的生长，生长曲线亦呈下降趋势。将菌落总数、C?值、:;值及酸度曲线作比较，在对数生长期，菌落生长繁殖快，代谢快，因此C?值、:;值及酸度变化趋势快；在生长稳定期C?值不变而:;值和酸度变化趋势趋缓，但仍呈上升趋势，说明菌数已基本维持不变，但代谢产物仍在不断增加；在衰亡期，菌落总数明显下降，而C?值、:;值及酸度基本维持不变，说明低:;值.3’对乳酸菌的生长有明显的抑制作用，在:;值"3D左右已明显有杀菌的作用。综上所述，保加利亚乳杆菌的最适收获期应为AK!DJ。考虑到在对数生长期末、稳定期初收获132菌可提高其在冷冻干燥的存活率6@7，这里选择在发酵培养!*J时收获。*3"*3"3!
132菌培养条件的确定发酵温度
每种菌都有自己的最适生长温度范围，只有在最适生长温度下，菌数才能达到最大。保加利亚乳杆菌的最低生长温度为**L，最高生长温度为D*3DL，
#$%&"’()$&!*’’*+,$,-%!./0
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图!1&2菌的生长曲线（!）
研究报告研究报告
最适生长温度范围是%"’%#(
)*+
。考虑到较低温度菌落总数，在厌氧培养箱中培养发酵的效果都要比普通生化培养和震荡培养的效果要好，几乎是普通培养的%倍。可能是厌氧条件下培养的保加利亚乳杆菌的代谢途径产生了大大促进其自身生长的物质；另一方面./值已下降到#->,，说明厌氧条件下培养的6-7菌更能耐酸。!-%
基础培养基的营养强化)$"+
基础培养基确定后，分别在此基础培养基中添加不同量的麦芽汁、番茄汁、乳清和碳酸钙等营养物质，对基础培养基进行营养强化，乳酸菌是异养型微生
下培养乳酸菌产生的不溶性多糖对处于干燥过程中的菌种有保护作用，因此选择#,(、%"(和%!(做对照实验，结果见表!。
由表!可以看出，在%"(发酵的菌液生长繁殖最旺盛、产酸也最多。因此选择在%"(培养保加利亚乳杆菌。!-#-!
培养基初始./值的确定)*+
用无菌的01!23#溶液或乳酸溶液调节培养基的初始./值，确定一系列./值点。培养$!4后测定发酵液中的活菌数，见表#。
物，营养要求复杂，需要多种生长因子。因此，选择了多种物质做单因素实验，结果如表5所示。
从表5的实验数据表明，只有蕃茄汁和麦芽汁较为明显的促进了保加利亚乳杆菌的生长，其余的
初始./值为5-,"时，菌数最从表#可以看出，
高。初始./值过高或过低都不利于6-7菌的生长。由于改良89:培养基的初始./值为5-&’5-,，所以在配制培养基时只需添加少量的碱液即可。!-#-#
培养方式的确定
在发酵罐内可以通入过滤除菌的0!和23!以降低反应液氧化还原电势，这对保加利亚乳杆菌尤为重要。保加利亚乳杆菌属于兼性厌氧菌，不同的生长环境会有不同的代谢途径，不同的代谢产物对自身的生长也有不同的影响。
配制改良89:培养基$"";6置于!5";6三角瓶中，按%
反而有所下降。除了有实验误差的因素外，可能的原因是：!物质对6-7菌生长有影响，可能不是同一时间达到菌数高峰值；"6-7菌更容易吸收和利用葡萄糖；#补脑汁和果珍作为商业产品，不可避免的加入了防腐剂等添加剂，可能会对6-7菌的生长带来不良影响，补脑汁中的磷酸可能破坏了磷酸盐缓冲体系；$加?@:3%的样3=值较对照值高，而./值稍低，说明可能是稀释有一定误差，而且?@!A的作用则与原培养基中8@!A的作用相似，都是作为酶激活剂，因此对6-7菌的生长影响不大；%甲酸应该能促进6-7的生长，但是由于加甲酸在调初始./值时被碱中和了，生成了甲酸盐，不仅不能为6-7菌所吸收利用，反而破坏了培养液平衡体系。!-5
6-7菌培养基的正交试验设计
考虑到蕃茄汁和麦芽汁之间可能存在联合协同的交互作用，因而采用正交试验法。资料表明，21!A和乳清对保加利亚乳杆菌的生长有明显的促进作用，因而均可作为一因素考虑。正交实验采取四因素三水平设计方法B以改良89:培养基为基础培养基添加C，衡量指标以发酵液中的活菌数表示，正交试验分
从表%可以看出，无论是3=值、./值，还是$%
总第$%&期）!""!年第#"卷第$期（
析表中的菌落总数为#
次平行实验的平均数，具体
研究报告
因素水平项目设计及数据处理结果如表0所示。
长，但也不是无限增长。因为中和产生的乳酸盐同样对:7?菌的生长有抑制作用，至+/F，积累的乳酸盐已明显抑制其生长。
图’:&?菌流加碱中和试验
’结论
,!1通过单因素实验，找到培养:7?菌的最佳培
养条件：培养温度/(I：培养基初始@A值为"7G；培养采取厌氧培养。
,+1对基础培养基进行强化，得到培养:7?菌的
由表0可以看出，2、3、4、5四因素的交互作用影响比较显著，各因素对保加利亚乳杆菌的增菌效果影响大小顺序依次为：2636465。由试验结果优化的最佳增菌培养基配方为2’3’4’5!，按此组合配制的增菌液接种活化两代的保加利亚乳杆菌后的增菌效果在!7(8!(!(9:;!以上。确定营养物质的最佳组合，得到优化培养基。+70
:7?菌液流加碱中和试验
由于:7?菌在生长繁殖过程中会产生引起培养基@A值改变的代谢产物乳酸等，如不适当的加以调节，就会抑制甚至杀死其自身。调节@A值的方法有两种：内源调节和外源调节
B!!C
优化培养基：改良培养基JK7"E番茄汁J!+E麦芽汁J(7((H9$%L:4.4%+J+E乳清。
,’1通过:7?菌的流加碱中和实验，以+(E*.+4D’溶液作中和剂，将培养液的@A值控制在"7G(，培养!"F时:7?菌的活菌数可达到H7""8!(!(9:;!。
参考文献：
B!C梁勇，杜敏7浓缩乳酸菌发酵剂的制备BMC7中国乳品工业，!HH"，
+’,’1：!’+;!’’7
B+CD>3D=*N=&3.O-PQR.%S-.Q-PQOT%-TQPSU$QU$$VSBMC&5.RQW=PS，!HG(，
/KX!/!&
B’C房兴利，晋津&酸奶生产液体发酵剂的研究BMC7中国乳品工业，
!HH/，++,"1：+(K;+(G，++G7
B/C吕兵，张国农，肖光辉7新型酸奶发酵剂的研究BMC7中国乳品
工业，!HHH，+K,"1：H;!!，!07
B"C刘宇峰，王金英7直接使用型酸奶发酵剂的研制BMC7中国乳品工
业，!HH"，+’,01：+K/;+KH7
B0C杜连祥，赵征&乳酸菌及其发酵制品生产技术B
科学技术出版社，!HHH&!!7
BKC乔东发&浓缩乳酸菌发酵剂的现状BMC7中国乳品工业，!HHG，+0
,!1X++;+’7
BGC许本发，李宏建，柴金贞&酸奶和乳酸菌饮料加工B
中国轻工业出版社，!HH/7
BHC史媛英，肖冬光7酸奶发酵剂高浓度培养的研究BMC&天津轻工
业学院学报)!HHH，+";+G7
B!(C张兰威，鄂志强，万海峰&乳酸菌增菌培养基筛选及干燥保护
剂的选择BMC7中国乳品工业，+(((，+G,+1XK;!(，!G7B!!C>2*5Y*NZ&5.RQWS-.Q-PQSQP[RP\PVBMC75.RQW>OR)!HKK，0(：’KG7
。原改良培养基
采用的是内源调节方式中的磷酸盐缓冲液方式。但从正交实验的结果来看，由于:7?菌产酸过多，以致单靠缓冲体系无法维持正常的@A值，而4.4D’是不溶性且是沉淀性的，故在配制的培养基中分布很不均匀，因此考虑用外源调节方式。即在发酵过程中流加碱以中和:7?菌发酵糖类产生的大量有机酸来维持适宜的@A值。本研究为了消除低@A值对:7?菌生长的抑制作用，在其生长过程中流加+(E*.+4D’溶液以中和产生的酸，每隔’F测定!次活菌数，并调节@A值为"7G，结果见图’。
从图’可以看出，加碱中和试验样的菌数已接近!(!(9:;!，已明显高于其参照样，在!"F达到最大值，达H7""8!(!(9:;!，且其生长稳定期维持较长，菌落生长抑制维持到!GF，而且其最佳收获期也随之延迟0F。虽然菌数在!GF以前一直在增
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