DOI :10. 13989/j . cn ki . 0517-6611. 2007. 24. 098
安徽农业科学, J ou rn al of An hui Agri . Sci . 2007, 35(24) :7383-7384, 7387 责任编辑 罗芸 责任校对 李菲菲
连翘乙醇提取物对细菌生长曲线的影响
黄冈师范学院生命科学与工程学院, 湖北黄冈438000) 刘世旺, 徐艳霞, 郑永良 (
摘要 研究连翘乙醇提取物的抑菌活性。以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为实验菌株, 通过比较和分析不同连翘提取物浓度下细菌生长曲线的变化来研究连翘的抑菌作用特点。结果发现0. 01g /ml 的提取物对摇床培养的金黄色葡萄球菌生长具有较强的抑制作用; 0. 10g /ml 的提取物对摇床培养的大肠杆菌生长具有一定的抑制作用。由此表明, 连翘乙醇提取物具有明显的选择性抑菌作用。关键词 连翘; 乙醇提取物; 生长曲线; 抑菌作用
中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007) 24-07383-02Effect of the Ethanol E xtract o f Forsythia suspensa (Thunb . ) V ahl . on the Grow th C urve of Bacterium LIU S hi -w ang et al (Life Science and Engineering College , Hu an ggang Norm al Un iversity , Hu an ggang , Hu bei 438000) A bstract To in vestigate the anti microbial effect of Fo rsythia sus p ens a (Thu nb . ) Vahl . Methods :T o draw the growth curve of S . aureus and E . coli by de -terminin g O D 420, an d to stu dy the affect accordin g to t he chan ge of the growth curve . Results :0. 01g /ml extract of Fo rs ythia su sp ens a (T hun b . ) Vahl . has obvious an timicrobial effect on S . aureus , and 0. 10g /ml extract of F or sythia s us pens a (Thu nb . ) Vahl . h as som e antimicrobial effect on E . coli . Concl u -sion :The ethanol Extract of F or sythia s us pen sa (Thun b . ) Vahl . h as selective ob vious antimicrob ial effect . Key w ords Fo rs ythi a su sp ens a (Th unb . ) Vahl . ; Ethan ol E xtract ; Gro wth Curve of Bacterium ; An ti microbial Effect
连翘[Fors ythia suspe nsa (T hu nb . ) Va hl . ]为木犀科(Olea cea e ) 连翘属植物, 中药连翘实为连翘植物的干燥果实, 气微香、味苦, 含连翘酚、齐墩果酸、6, 7-二甲氧基香豆精、甾醇化合物、黄酮醇甙及皂甙等。连翘具有清热解毒, 消肿散结之功效。可用于治疗痈疽、瘰疠、乳痈丹毒、风热感冒、高热烦渴等症[1]。但目前, 连翘药理方面的研究较少, 连翘抑菌消炎方面的研究报道更少[2]。笔者开展连翘乙醇提取物影响细菌生长曲线的研究, 对于进一步了解该植物药用机理和综合开发利用该植物具有重要意义。1 材料与方法
1. 1 实验材料 连翘购自湖北省黄冈市中药材公司; 金黄色葡萄球菌(Staphyloc oc oc us au reus ) 和大肠杆菌(Esc he ric kia c oli ) 菌种由黄冈师范学院省级生物实验教学示范中心提供。1. 2 实验仪器 分光光度计(752紫外可见分光光度计) 、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、恒温水浴培养摇床、旋转蒸发仪、真空泵、电子天平、移液枪等。
1. 3 培养基配方[3] 牛肉膏固体培养基:牛肉膏3g , 蛋白胨5g , NaCl 5g , 蒸馏水1000ml , 琼脂15～20g , p H 7. 4; 察氏液体培养基:Na NO 32g , K 2HP O 41g , KCl 0. 5g , Mg SO 40. 5g , Fe SO 40. 01g , 蔗糖30g , 蒸馏水1000ml , p H 自然。
1. 4 水分测定及乙醇提取物制备 称取连翘材料20. 00g , 置于75℃恒温烘箱中烘11h 左右至恒重得19. 24g , 所以实验用连翘材料的含水量为3. 8%。另取2kg 连翘(折算后干重为1924g ) 置入95%酒精中浸泡30d , 期间经常搅拌。然后用棉花阻隔过滤, 旋转蒸发仪蒸发浓缩, 得膏状物1554. 67g 。通过烘干和称重得知被乙醇浸泡提取后的连翘残渣干重为1369. 35g , 可见连翘原材料中有554. 65g 成分被提取进入膏状物中, 膏状物的含水量为64. 3%,1g 膏状物相当于1. 24g 干燥连翘。膏状物冷藏备用。
1. 5 培养基及实验用品灭菌 配制察氏液体培养基360ml ,
基金项目 湖北省教育厅重点科研项目(D200727001) 。
作者简介 刘世旺(1965-) , 男, 湖北武汉人, 硕士, 副教授, 从事生物化
学和植物资源学方面的教学和科研工作。
均分装于36支试管中; 配制牛肉膏固体培养基500ml ; 将以
上两种培养基和若干包扎好的试管、小烧杯、移液枪枪头等置于高压灭菌锅内, 121℃湿热灭菌20min ; 然后于超净工作台上趁热将部分固体培养基分装于4支已灭菌的大试管中制成斜面。将所有分装好的培养基及斜面置于37℃恒温培养箱中做无菌检测实验, 无污染的斜面用于活化菌种, 液体培养基用于后述分组实验。1. 6 液体培养基分组 将准备好的装有察氏液体培养基的36支试管分为2组:A 组即金黄色葡萄球菌组, B 组即大肠杆菌组。每组设0. 50、0. 25、0. 10、0. 05、0. 01和0g /ml (CK ) 等6个连翘提取物浓度梯度, 并按梯度要求分别称取冷藏备用的连翘乙醇提取物5. 0、2. 5、1. 0、0. 5和0. 1g 分别煮沸并加入到对应试管中。由于每支试管中已有察氏液体培养基10ml , 所以提取物加毕即符合上述设计的浓度梯度要求。然后再向每支试管中接入已活化的对应菌液0. 1ml , 适当振荡混匀。3次重复。贴上标签, 准备进行O D 420测定和摇床培养。1. 7 OD 420值的测定和微生物培养 制成上述混合培养液后即进行第一次O D 420值的测定, 测定时以未接种且未加入连翘提取物的察氏液体培养基作空白(CK ) 。测定后将试管置于37℃恒温培养摇床中培养。之后每间隔2. 5h 测定并记录OD 420值一次。在测定过程中应尽量减少培养液在空气中的暴露时间, 所用枪头和移液管应在每次吸取液体后进行更换, 试管中的液体在吸取前应适当振荡。每次测定完毕后, 须用液体培养基涮洗比色杯3次。每次读出的OD 420值最好不超过0. 40, 超出时, 应进行适当稀释并重新测定, 测定的OD 值乘以稀释倍数后即为实际的O D 值[4]。1. 8 细菌生长曲线的绘制 根据所测数据求出O D 420平均值, 然后以OD 420为纵坐标、时间为横坐标绘制生长曲线。2 结果与分析
在不同提取物浓度下测得A 组的生长曲线如图1, B 组的生长曲线如图2。由于连翘提取物本身对OD 值会产生影响, 而每支试管中加入的提取物的量又各不相同, 所以使得图1和图2中各条曲线的起点不同。
图1、2中的曲线虽然可清晰地显示不同浓度培养液中
7384 安徽农业科学 2007年
生长曲线。设法剔除连翘提取物对O D 值的影响、将各条曲线置于同一起点上, 将有利于生长曲线的比较和分析。从图1和2可看出, 0g /ml 浓度组(CK ) 0h 时的O D 值是培养基和起始菌液二者吸光度的总和, 而其余各浓度组0h 时的O D 值则是培养基、起始菌液和连翘提取物三者吸光度的总和。上述2个总和的差值即可近似地认为是连翘提取物的吸光度。将含连翘提取物的各浓度组的O D 值减去连翘提取物本身的O D 值(即上述差值) , 其结果即可近似地反映出不同时间培养液中菌体的实际浓度, 由此作出的生长曲线将具有相同的起点。按照这一处理方法, 分别得出A 组、B 组的校正生长曲线如图3、4
。
这一特征也可看作是抑制作用的一个方面。
从图4也可看到与图3相类似的特征, 但生长曲线的稳定期区段位于对照组之下的实验组是0. 10g /ml 组, 这表明
0. 10g /ml 的提取物浓度是抑制大肠杆菌生长较适宜的浓度。
图4 不同提取物浓度下大肠杆菌的校正生长曲线
3 讨论
生长曲线直观地显示了生物量随时间而变化的过程和规律, 同时还包含了许多种群生态学的信息和特征。一定培养基中微生物的生长曲线实际上是逻辑斯谛模型(L ogistic model ) 的一个具体应用[5]。根据微生物的生长曲线可求出瞬
图1 不同提取物浓度下金黄色葡萄球菌的生长
曲线
时增长率r , 如r 值很大, 表明群体增长迅速, 而r 的倒数则表示培养体系受到外界干扰后能很快地返回到平衡状态; 如r 值很小, 结果则相反。可见, 利用生长曲线的变化揭示药物的抑菌效果, 不同于以往直接求MIC (最小抑菌浓度) 的方法。MIC 只能定性地判断药物对细菌有无作用, 却无法揭示药物对细菌群体整个生长增殖周期的影响情况。生长曲线则可反映微生物的群体生长规律, 从生长曲线中可探知微生物对环境的适应快慢程度、微生物对培养基成分的利用情况、药物中不同成分对微生物产生的不同作用以及药效最强和最弱的时间等多种有意义的信息。
加入连翘提取物后菌体的生长曲线都或多或少地发生了一些变化, 其中比较普遍的现象是对数生长期提前、对数期曲线变得平缓, 尤其是较高浓度组的曲线, 迟缓期几乎为零, 菌体生长几乎直接进入对数期。实验中迟缓期缩短甚至消失的原因可能是连翘提取物中的某些成分作为菌体生长的“营养物质”被其利用, 或某些成分刺激菌体发生了应激反应, 进而出现提前增殖现象。分离和研究这些具有刺激作用的活性成分, 在微生物发酵工程领域具有很好的应用前景。提取物浓度与抑菌作用强弱之间并不成简单的正比关系, 另外, 抑制作用的发生还具有很强的时效性, 这一点提示我们, 在进行中药抑菌活性研究时, 应认识到中药成分的复杂性和各种成分性质的差异性, 多种成分同时存在时可能仅存在“最适抑菌浓度”。
药用植物成分复杂、作用多样, 有些成分可能会促进细菌生长繁殖, 有些可能作为菌体生长的抑制因素, 影响菌体正常的生长和增殖, 还有一些成分可能会使菌体产生钝化酶、菌膜等进而出现耐药性[6]。以上3种因素综合作用, 此消彼长, 将使药物作用过程和机理更加复杂, 所以, 综合研究药用植物成分对菌体生长的不同作用是一个新的研究方向, 具有非常广阔的发展空间。
(下转第7387页)
图2 不同提取物浓度下大肠杆菌的
生长曲线
图3 不同提取物浓度下金黄色葡萄球菌的校正生长曲线
从图3可见, 连翘提取物0. 01g /ml 组生长曲线的稳定期区段位于对照组之下, 表明此时葡萄球菌生长受到明显抑制; 而其余4个高浓度组则相反, 生长曲线的稳定期区段位于对照组之上, 表明此时菌体生长不但未受到抑制, 反而还受到促进。同时, 生长曲线的对数期区段一般比对照组平
缓,
35卷24期 秦志列等 不同种植方式对光温敏雄性不育小麦育性表达的影响7387
图1 2006年光温敏雄性不育小麦BS 210自交结实穗(花) 位分布
3 结论和讨论
在光温敏水稻和光温敏小麦研究中, 育性的稳定表达是评价一个不育系优劣的重要标准。光温敏水稻研究表明, 经
多世代单株选择之后, 育性仍在继续分离[9]。育性的遗传受细胞核内隐性基因控制, 与细胞质无关, 不同来源的光温敏核不育材料受控于不同的核不育基因位点[10]。同时, 光温敏不育系的育性得以完全表达所需的光温临界值在不同繁殖世代中会发生变化, 如不育起点温度随繁殖代数增加而发生“漂移”的现象[11]。这些都是导致育性表达出现波动的重要因素。除遗传因素外, 光、温等环境条件对育性表达也产生影响。该研究表明, 通过播种时期、播种密度、播种行距的调整, 可以实现光温敏雄性不育小麦育性的差异性表达, 说明各因素对育性均有影响, 其中播种时期的影响最大, 且因素间存在显著的互作效应。此外, 由于不同年度间光、温等环境条件的差异, 同一不育系的育性也存在差异, 即使种植在相同光温条件下, 个体间育性也颇不一致, 表现在株间、株内穗间、穗内小穗间、小穗内小花间。对单穗而言, 其第5～10小穗是自交结实比例较高的部位, 关于该部位较容易自交结实的原因有待进一步研究。(上接第7384页) 参考文献
[1]赵新先. 原色中草药图谱[M ]. 广州:世界图出版公司, 2003:152-292. [2]段纲, 代飞燕, 朱春贤, 等. 中草药复方提取物的体外抑菌试验[J ]. 黑
龙江畜牧兽医, 2005(7) :71. [3]黄秀梨. 微生物实验指导[M ]. 北京:高等教育出版社, 施普林格出版
社, 1999:114-115.
参考文献
[1]何觉民, 戴君惕, 邹应斌, 等. 两系杂交小麦的理论与实践[M ]. 长沙:
湖南科学技术出版社, 1993. [2]W IL S ON J A , R O SS WM . Male s terilit y in terac tion of th e T ritic um aest ivu m n u -cleu s an d T riticu m ti moph eevi cytop las m [J ]. W h eat in f S erv , 1962, 14:29-30. [3]TOR IY AM A K , TSU NEW AK I K , NO NA KA S , et al . A b reed in g s che me p rop osed
for h ybrid wh eat u til izin g mal e s terility ind u ced b y th e in teraction bet ween an Sv type c yt oplas m an d a 1BL -1R S ch romosome [J ]. Japan J Breed , 1993, 43:517-524. [4]MUR AI K K . TS UN EW A KI . Ph otop eri od -s ens itive cytopl asmic male sterili ty in
wh eat wit h Aegilop s Crassac ytoplas m [J ]. Eu ph ytica , 1993, 67:41-48. [5]徐乃喻, 刘江东. 光同期敏感细胞质雄性不育小麦的初步研究[J ]. 武
汉大学学报:自然科学版, 1995, 41(2) :218-223. [6]LI Y UN F U , CHA N GPIN G ZHA O , FE NG TING Z HAN G , et al . Fertil ity Alterati on in t he Phot o -Th er mo -Sen sit ive Mal e S teril e Lin e BS20of W heat (T rit icu m a es -tivu m L . ) [J ]. Eu ph ytica , 2006, 151:207-213. [7]张建奎, 冯丽, 何立人, 等. 温光型核雄不育小麦育性转换的温度敏感
期和临界温度研究[J ]. 应用生态学报, 2003, 14(1) :57-60. [8]何蓓如, 董普辉, 宋喜悦, 等. 小麦温度敏感不育系A3314温敏特性研
究[J ]. 麦类作物学报, 2003, 23(1) :1-6. [9]张廷璧. 湖北光敏感核不育水稻的遗传研究[J ]. 中国水稻科学, 1988,
2(3) :123-128. [10]廖伏明, 袁隆平. 光温敏不育水稻不育性表达不稳定的遗传机制与原
因综述[J ]. 杂交水稻, 2003, 18(2) :1-6. [11]袁隆平. 水稻光、温敏不育系的提纯和原种生产[J ]. 杂交水稻, 1994
(6) :1-3.
[4]T HR O PE T C , WIL SO N M L , TUR N ER J E , et al . Back /Alertan a uto mat ed co -lerimetric microb ial d etecti on s yste m [J ]. J Clin Micro , 1990, 28(7) :1608-1610. [5]孙儒泳. 动物生态学原理[M ]. 3版. 北京:北京师范大学出版社, 2001:181-185. [6]路振香, 谢文科. 八味中药提取物的体外抑菌试验[J ]. 中西医医药杂
志, 2005(3) :37-39.