《广州食品工业科技》 GuangzhouFoodScienceandTechnology Vol.19No.2(总75)
分离纯化新技术亲和层析
陈 涛 刘 耘 潘进权
(华南理工大学食品与生物工程学院 广州 510641)
摘 要 本文介绍了亲和层析的一般问题,综述了固定化金属亲和层析、免疫亲和层析和其它一些类型的亲和层析的原理和应用。
关键词 亲和层析;原理;应用
Anewtechnologyofisolationandpurification:affinity,(collegeoffood&oftechnology,Guangzhou,510640)
Abstract ofaffinitychromatography.SummarizethemechanismandapplicationofImmobilizedMetalLonAffinity(),Immuno-affinityChromatographyandotherkindsaffinitychromatographty.
Keywords affinitychromatography;mechanism;application
亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。近几十年来,亲和层析技术发展十分迅速。对于那些分离流程长、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说,亲相层析枝术就显示出其独特的优越性。亲和层析在分离、纯化的效率上可以说是最重要的方法之一。
1 亲和层析的一般问题1.1 配基的选择
专一结合的维生素做配基。纯化激素受体蛋白,选择相应的激素做配基,纯化核酸可以根据核酸与蛋白质的相互作用、脱氧核糖核酸分子中不同互补链之间、
DNA和RNA之间杂合作用的关系选择合适的配基。
1.2 载体的选择
将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面(孔内)即可制备亲和吸附介质,该固体粒子通常称为配基的载体。因此,亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求:(1)具有亲水性多孔结构,无非特异性吸附,比表面积大;(2)物理和化学稳定性高,有较高的机械强度,使用寿命长;(3)含有可活化的反应基团,用于亲和配基的固定化;(4)粒径均
[1]
一的球行粒子。常用的亲和层析载体有:琼脂糖凝
胶和交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶(ACA)、纤维素、多孔玻璃等。其它用于载体的物质还有:聚苯乙烯[2]、淀粉珠[3]、魔芋葡甘聚糖[4]、壳聚糖[5]、硅胶[6]等。1.3 洗脱问题
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶性载体相偶联制成亲和吸附剂,这样一对生物分子中,被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中,究竟选择哪一种物质作配基,要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质,选择与其
收稿日期
:2003-01-14
洗脱亲和吸附剂上吸附的物质大多采用非特异洗脱的方法,通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低,以至解开生物高分子和亲和吸
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《广州食品工业科技》 GuangzhouFoodScienceandTechnology Vol.19No.2(总75)附剂之间的结合。假如那些纯化对象和亲和吸附剂的亲和力不强,当连续通过大体积的平衡缓冲液时,便可在紧随杂蛋白洗出峰后,得到纯化对象的组分。对于那些吸附得比较牢固的大分子,必须用较强的酸或碱作为洗脱液。也可以用特异洗脱的方法,利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂,通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合,脱附目标产物。另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点,当吸附生物大分子以后,可以用还原剂断裂重氮键或用羟胺断裂硫脂键,从而得到生物大分子和配基的络合物,然后将络合物解离,再分出欲纯化的生物大分子。
2 固定化金属离子亲和层析2.1 基本原理
组氨酸的咪唑基团,哚基团可提供电子,,体表面会减少蛋白质-金属相互反应的自由度,蛋白质也因此不容易失活,在后继的分离纯化过程中仍然保持较高活性。2.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法
2+
将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn、2+2+Ni、Co)缓冲液中,直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体,通常是多聚物(如交联化的琼脂糖,葡聚糖),配位体(亚氨基二乙酸,IDA)共价连接.当在缓冲液中浸泡平衡后,经洗涤,可将含有生物活性物质的样品上柱,与固定化金属-配基有亲和力的分子都将被滞留,其余则流出柱外。2.3 固定化金属离子亲和层析的优点
和传统的亲和层析相比,固定化金属离子亲和层析具有以下优点:(1)配基稳定性高,不易脱落;(2)金属离子配基价格低廉,再生成本低;(3)可在高盐浓度下操作,从而省去了脱盐的预处理步骤,而且可以减少非特异性吸附;(4)蛋白质洗脱比较容易,采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑或EDTA便可将吸附蛋白解吸下来。由于IMAC的这些优点,已广泛用于酶
[7]
和干扰素的分离纯化中。2.4 应用举例
[8]
YiLi等研究了一种利用金属螯合亲和层析使绿色荧光蛋白质(GFP)复性的方法。研究中发现,GFP
对Cu2+和Ni2+有较强的亲和能力,而与Zn2+、Co2+结
)-IMAC系统合能力较差。研究结果表明,在Ni(Ⅱ
中,流动相中NaCl的浓度变化能引起GFP纯度和产量的较大变化,在高浓度NaCl条件下分离效果较好。王雪蜂、陈美[5]等从虾壳制备所得壳聚糖为基质合成金属螯合亲和吸附剂,用于纯化猪血铜锌超氧化物歧化酶(Cu・Zn-SOD),得到比活为4756U・mg-1的酶蛋白,收率为67%,纯化倍数为61。聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色定位表明,经螯合层析纯化后的酶纯
[9]
度基本均一。LinaGelunaite等用亚氨基双乙酰酯琼脂糖凝胶螯合Hg离子制成亲和层析柱,通过改变洗。,]等设计了一种利。其中所用的亲和层
-IMAC系统。利用磷酸化肽与CaⅢ)的亲和能力,研究人员用该柱选择性的结合被胰蛋白酶消化的牛奶中的磷酸化肽,效果良好。3 免疫亲和层析
抗原和抗体的作用具有高度的专一性,并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上,便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。3.1 抗体的纯化
抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要,所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得。尽管直接使用上述未纯化的抗体溶液也可进行一些免疫学实验,但要获得满意的结果最好使用纯化的抗体,特别是亲和层析所用的抗体。
利用细菌胞壁蛋白的特性提供了一个快速、简捷、高效的抗体纯化方法。这里细菌胞壁蛋白主要是指蛋白A和蛋白G,它们分别从金黄色化脓性葡萄球菌和G组链球菌分离纯化。它们能特异结合到免疫球蛋白的Fc部分(Y
字IgG分子的主干部分)。因为两种蛋白对不同的免疫球蛋白的亲和力不同,所以应根据免疫球蛋白的种类选择蛋白A或蛋白G。天然的蛋白A或蛋白G具有白蛋白结合部位,使用时会导致白蛋白的污染,市售的已除去白蛋白结合部位的工程产品避免了上述缺陷。蛋白A不与抗体(IgG)的抗原结合部位结合,而且任何抗体的Fc片段都非常类似,因此蛋白A可以作为各种抗体的配基,但与不同抗体的结合常数有所不同,此外,蛋白A与抗体结合
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Vol.19No.2(总75)并不影响抗体与抗原的结合能力,因此蛋白A也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。Walker[11]等和
[12]
Coligan等介绍了使用抗抗体免疫亲和柱,它由抗目的抗体Fc片段的特异抗体组成。其纯化效果与蛋白A或蛋白G一样好。值得注意的是在纯化过程中要检测抗体的活性,以便确定目的抗体是否仍保留其活性。3.2 抗原的纯化
在蛋白质纯化中用抗体亲和纯化抗原是非常有效的方法。一般纯化倍数可达到1000～10000。如果抗体与目的蛋白的结合的特异性得到证明,并且经过洗脱的目的蛋白没有受到可逆的损伤,那么抗体亲和纯化将是理想的蛋白质纯化方法。
制备免疫亲和柱一种方法是抗体首先结合到介质上。另一方法[13]是将抗体结合到蛋白A或蛋白G小珠上,再用交联剂固相化。蛋白G结合在抗体的Fc区,得充分暴露,,抗,,然后洗脱抗原,如来洗脱,只能采用非特异性洗脱。但非特异性洗脱一定要小心,以免目的蛋白失活。
抗体亲和纯化的质量很大程度上取决于抗体溶液的纯度,制备亲和柱的抗体既要良好的特异性和活性,又要尽可能的纯。抗体亲和柱的制备是相当昂贵的,其结合容量却相对较低。因此为了节省和提高效率,经常制备的是小而粗的柱子,同时在亲和纯化步骤里要求样品溶液重复几次上样,以便纯化更多的抗原蛋白。此外,较小的柱子也可以减少和限制柱污染和抗体丢失。
赵益明、何杨[14]等用单克隆抗体亲和层析从人血小板破碎液中纯化血小板第4因子(PF4)。将单克隆抗体SZ-95-LgG与溴化氰活化的Sepharose4B凝胶连接成亲和层析柱SZ-95-LgG-Sepharose4B,人血小板破碎液经此亲和层析柱上样后,经洗脱获得PF4,采用15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度,用点印迹鉴定其免疫活性。结果表明,SZ-95-Sepharose4B亲和层析柱的偶联率为72%,每1ml血小板破碎液中可以纯化到PF418ug,其相对分子量约为12kD,经点印迹显示与单抗SZ-95反应显带。该层析柱纯化PF4效果较好。4 其它类型亲和层析
与亲和配基相偶联,用来分离纯化与亲和吸附介质具较强亲和力的酶,结合蛋白,激素,基因表达产物等物质,不需要利用金属离子或抗体抗原性质,这样的亲和层析种类繁多、应用广泛,已取得不少进展。4.1 染料亲和层析
一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构,因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶,对这些染料有一定的亲和力,如果这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上,就能制得染料亲和层析柱。亲和染料层析已经成功的分离纯化了许多酶,如分离纯化需以NAD+、
NADP、ATP、水解酶、转移酶、
+
核酸酶、tRNA合成
[15]
酶等研究了谷胱甘
。所用的染料是二氯三嗪,其中活性部分结构与谷胱甘肽类似。用此种亲和吸附剂分别纯化三种作用于谷胱甘肽的酶
NAD+、甲醛脱氢酶(FaDH)和谷胱甘肽-S-转移酶,
效果良好。4.2 多肽亲和层析
多肽是亲和层析纯化生物大分子更有效的配基。因为其只含有一些氨基酸,所以即使脱落进入产物中也不会引起免疫反应。多肽配基与抗体配基比较起来稳定性更好,它们能在GMP条件下进行大规模的无菌生产,可以大大降低成本。与金属和染料相比,多肽具有较高的特异性,且通常是无毒的。多肽具有与蛋白质相似的结构,因此它们的作用通常是温和的,因此在分离过程中可以采取温和的洗脱条件,可以避免蛋白质的变性、失活。H.Arostova[16]等用碘化的L-酪氨酸与琼脂糖交联制备亲和层析柱纯化猪胃蛋白酶,效果良好。但是,自然界存在的与蛋白质等生物大分子具有天然亲和性的多肽种类毕竟有限,这大大限制了多肽亲和层析的应用。4.3 人工设计小分子配基亲和层析
传统的单克隆抗体及天然大分子有高度专一的立体结构,是较为理想的亲和介质,但这些大分子本身需要高度纯化,成本昂贵且生物化学性质不稳定,纯化中难以维持结合活性,近年来发展起来的仿生亲和小分子配基新技术,对于纯化的目标蛋白在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基,然后将其固定到支持介质上,这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定,特异性及重复性
[17]更好。
以普通凝胶、多孔玻璃珠等物质作为载体,直接100
《广州食品工业科技》 GuangzhouFoodScienceandTechnology Vol.19No.2(总75)4.4 融合基因表达产物的纯化
随着基因重组技术的发展,人工克隆目标产物的基因,使其在大肠杆菌、酵母或动植物培养细胞中得到表达,从而通过规模菌体发酵或细胞培养大量生产特定目标产物已经相当普遍,绝大多数现代生物技术医药产品如干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、集落刺激因子、胰岛素(insulin)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、促红细胞生成素(EPO)等基因重组的产物。同时,从目标产物分离纯化的角度,将具有特殊分子识别作用
(亲和作用)的物质(如氨基酸、肽链、蛋白质等)的基
展方向。21世纪是生物工程的世纪,在本世纪,将有
更多的生物制品可以用亲和层析进行分离纯化,亲和层析必将得到更深入的研究和更广泛的应用。
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因与目标产物的基因克隆相连接,制备融合基因,则此融合基因的表达产物就是连接有特定分子识别基
团的目标蛋白质─基因重组融合蛋白质,简称融合蛋白。与目标蛋白相融合的分子基团称为融合蛋白的亲和标识物。这样利用亲和标识物的特异性亲和吸附介质就可以简单地纯化目标产物芝等以0.4mmol/LIPTG21a-重组质粒的BL21(3,TPu2rificti,将SDS-PAGE蛋白区带转移至。外源性Tropic1808基因在大肠杆菌中表达的融合蛋白可经
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随着现代生物技术的飞速发展,各种生物制品不断涌现出来。这就要求有更先进、更高效的分离纯化各种生物制品的方法,亲和层析就是在时代的要求下形成、发展和不断完善的。亲和层析技术的最大优点在于,利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高纯度的活性物质,该技术不但能用来分离一些在生物材料中含量极微的物质,而且可以分离那些性质十分相似的生化物质。利用亲和层析技术成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品。但亲和层析也有一些缺点,主要是载体(如琼脂糖)价格昂贵,机械强度低;配基制备困难,有的配基本身需要分离纯化;配基与载体偶联条件激烈等。因此,新型载体的研究开发,利用分子组合技术建立组合分子库筛选小分子配基,将是亲和层析的重要发
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