第34卷 第1期
2008年1月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版) Jo ur na l of Jilin U niver sity (M edicine Edition) V ol. 34N o. 1 Jan. 2008101
[文章编号] 1671-587 (2008) 01-0101-04
人参皂苷单体Rh 2对小鼠前胃癌MFC 细胞的增殖抑制作用
吴 歌, 杨世杰
(吉林大学基础医学院药理学教研室, 吉林长春130021)
[摘 要] 目的:探讨Ginseng Rh 2(G -Rh 2) 对小鼠前胃癌M F C 细胞的增殖抑制作用及其机制。方法:M FC
细胞(密度为1 0 109 L -1) 分为空白组、G -R h 2组(3、10、30mg L -1) 组, M T T 法检测M FC 细胞活
性; 流式细胞仪检测细胞周期; 流式细胞仪和免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白cy clin D 1、细胞周期依赖激酶
(CDK) 抑制蛋白p27kip1在M F C 细胞中的定性和定量表达。结果:与相应空白组比较, G -Rh 2(3、10、30mg L -1) 组在1、2和4h 细胞增殖活性随着剂量和时间增加而逐渐下降(P
比较, 各药物处理组G 0/G 1期细胞比率随着剂量增加而上升(P
D 1含量逐渐降低(P
过程可能与p27kip1升高、细胞周期蛋白cyclin D 1含量降低有关。
[关键词] 人参皂苷单体R h 2; M F C 细胞; 细胞周期
[中图分类号] R329 28; R735 2 [文献标识码] A
Ant-i proliferation effect of Ginseng Rh 2on MFC cells
WU Ge, Y A NG Sh-i Jie
(Depar tment of Phar maco lo gy , Schoo l o f Basic M edical Sciences, Jilin U niversit y, Chang chun 130021, China)
Abstract:Objective T o investigate the ant-i pro lifer atio n effect of G inseng Rh 2(G -Rh 2) on mo use M FC gastr ic
cells and its mechanism. M ethods M F C cells (1 0 109 L -1) w ere div ided into four g our ps:contro l gr oup and
G -Rh 2(3, 10, 30mg L -1) gr oups. T he cell v iability was determined by M T T ; the cell cycle was detected by
flow cyt ometry ; the pro tein expressio n o f cy clin D 1and p27kip1wer e o bser ved respectiv ely by qualitativ e and
quantitativ e analysis. R es ults Co mpar ed w ith co ntr ol gr oup, the cell viabilit ies decreased gr adually w ith the
incr easing of dose and time in G -Rh 2(3, 10, 30mg L -1) g ro ups at different t ime (1, 2, 4h) (P
P
time, the ex pression lev el of cell cy cle pr otein cyclin D 1decr eased (P
of p27kip1increased (P
arr esting cell cy cle, and the process may associate w ith p27kip1increase and cyclin D 1decrease..
Key words:Ginseng Rh 2; M FC cells; cell cy cle
人参皂苷单体Rh 2(Ginseng Rh 2, G -Rh 2)
是从红参参根中分离得到的原人参二醇型低糖链皂
苷单体, 各国研究者已在一些肿瘤细胞体外培养系
中[1-5]并初步揭示该过程与诱导细胞调亡、分化及阻滞细胞周期有关。而关于G -Rh 2对胃癌细胞增殖抑制和相关分子机制尚未见报道。本研究拟以小鼠前胃癌细胞株MFC 为研究对象, 观察不同浓度G -Rh 2观察到G -Rh 2对肿瘤细胞的增殖抑制作用,
[收稿日期] 2007-03-29
[基金项目] 吉林省科技厅基金资助课题(20040411)
[作者简介] 吴 歌(1978-) , 女, 吉林省长春市人, 在读医学博士, 主要从事肿瘤药理学研究。
[]T
102吉林大学学报(医学版) 第34卷 第1期 2008年1月
对胃癌细胞周期阻滞的作用, 并初步探讨相关的分
子机制。
1 材料与方法
1 1 药品及试剂 G -Rh 2由吉林大学分析化学教
研室提供, 由0 1%DMSO 溶解成600mg L -1的
母液, 使用时稀释到所需的终浓度; IMDM 培养
基购自美国Gibco 公司; 新生小牛血清购自杭州四
季清生物有限公司; PI 购自Sigm a 公司; Rnase
购自北京鼎国生物公司; 小鼠抗兔cyclin D 1和
p27kip1购自Santa Cruz 公司; FITC 标记山羊抗小
鼠IgG 盒购自中杉金桥; 辣根酶标记山羊抗小鼠
Ig G 购自中杉金桥; T riton -100购自上海生工;
DAB 购自福州迈新。
1 2 细胞来源及培养 MFC 细胞由本室冻存, 经
常规复苏后培养和维持在体积分数为10%新生牛
血清IM DM 培养液里, 置CO 2培养箱(37 ,
5%CO 2) 培养, 取对数生长期细胞经24h 无血清
培养后, 分组进行实验。
1 3 分组及给药 MFC 细胞(密度为1 0
109 L -1) 按设计要求分为空白组、G -Rh 2组(3、
10、30mg L -1) 组, 检测细胞活性、细胞周期
和cy clin D 1及p27kip 1表达。
1 4 MT T 法检测细胞活性 收获各组细胞, 每
组5复孔, 每孔190 L 接种于96孔培养板内, 分
别经用无血清和10%小牛血清中培养24h 后加入
G -Rh 2, 继续培养1、2和4h, 培养结束前每孔加
入10 L M TT (5g L -1cyclin D 1和p27kip1抗体(1 200) 100 L, 4 孵育过夜, 加FIT C 标记的羊抗小鼠Ig G (1 50) 100 L, 避光37 孵育45m in, 每步用400 L PBS 漂洗3次, 流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。以未加小鼠抗兔cyclin D 1和p27kip1抗体的样品作为阴性对照, 每个样品实际测得的平均荧光强度减去阴性对照的平均荧光强度, 即为抗原的相对表达水平。1 7 免疫细胞化学法分析cyclin D 1和p27在细胞中的表达 收集细胞, 将细胞涂布于预先用多聚赖氨酸包被的载玻片上, 4%多聚甲醛固定10m in, 水化10m in, 0 3%T rito nX -100作用15m in; 0 01m ol L -1PBS 冲洗3次, 每次5min; 按免疫组化试剂盒操作说明书进行染色; 滴加DAB, 室温避光显色15~20s, 水终止反应, 苏木素染核, 1%盐酸酒精分化, 蒸馏水返蓝, 梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明, 中性树胶封固, 镜下观察结果并拍照。结果采用image -pro tein plus 统计软件进行处理, 每张照片选择5个不重复染色阳性高密区, 计算蛋白表达棕黄色阳性区域平均光密度(IOD/A rea) 。1 8 统计学处理 采用SPSS 10 0统计软件, 组间平均光密度比较采用t 检验, 组内比较采用方差分析。2 结 果2 1 M FC 细胞活性 G -Rh 2各组无血清培养M FC 细胞活性明显降低, 与对照组比较差异有显
著性(P
间依赖性。而G -Rh 2各组10%小牛血清培养后的
M FC 细胞活性与对照组比较差异无显著性(P >
0 05) 。
2 2 MFC 细胞周期 对照组G 0/G 1期细胞占
28 56%, G -Rh 2各组G 0/G 1期细胞比率分别为
37 74%、77 99%和79 29%, 与对照组比较明
显上升(P
图2) ; G 2/M 、S 期细胞比率与对照组比较显著下
降(P
2 3 流式细胞仪检测结果 与对照组比较,
G -Rh 2各组cyclin D 1含量呈剂量依赖性下降(P
0 05或P
高(P
15min , 1%BSA 室温孵育2h , 加入小鼠抗兔-1
吴 歌, 等 人参皂苷单体Rh 2对小鼠前胃癌M FC 细胞的增殖抑制作用103
表1 流式细胞仪检测M F C 细胞cyclin D 1and p27kip1结果
T ab 1 Effect of G -Rh 2on cy clin D 1and p27kip1of M FC
cells by flo w cyt ometr y
Group
Control
G -Rh 23mg L -
1(n =5, s ) Cyclin D 1p27kip11714 1602212 193**2503 219**3102 287**3157 2562757 210*2102 198**1894 165** 10m g L -1 30m g L -1*
图1 M FC 细胞增殖活性
Fig 1 Effect o f G -Rh 2o n cell activ ity of M FC cells in each
gr oup P
group
图2 M F C 细胞周期
F ig 2 Effect o f G -Rh 2on cell cycle o f M FC cells
A:Control group; B:3mg L -1G -Rh 2; C:10mg L -1G -Rh 2; D:30mg L -1G -Rh 2
2 4 免疫细胞化学 cy clin D 1棕黄色阳性区域多
在胞核, 而胞质亦有少量表达, 与对照组比较, 随
用药剂量增加, G -Rh 2组平均光密度值逐渐下降
(P
达, 其平均光密度随剂量增加而升高(P
见图3(插页一) 和图4(插页二) 。
3 讨 论
人参皂苷是人参的主要活性成分, 在人参皂苷
单体中Rh 2的抑瘤活性最强, 体内外实验结果表
明, G -Rh 2可以时间和剂量依赖性方式抑制宫颈
癌[1]、肝癌[2]、脑胶质瘤[3]、肺癌[4]等多种肿瘤细
胞的增殖, 且其诱导凋亡与抑制增殖作用呈正相
关, 但目前尚无G -Rh 2对胃癌增殖抑制作用的研
究报道。
本研究发现, G -Rh 2对无血清培养后的M FC
细胞的生长抑制作用亦具有时间和剂量依赖性, 而
对10%血清培养后的MFC 细胞无明显抑制作用,
提示该药的血浆蛋白结合率较高, 这与费晓方等[6]
的报道一致。
细胞周期调控异常是肿瘤发生发展过程中最重, kip 1终导致肿瘤的发生, 而通过对细胞周期的有序调控可以达到抑制肿瘤增殖的目的[7, 8]。本研究结果显示, G -Rh 2对M FC 细胞周期的影响, 随着G -Rh 2剂量增加, M FC 细胞的G 0/G 1期细胞比率逐渐上升, 而G 2/M 期细胞比率逐渐下降, 说明G -Rh 2亦可通过G 0/G 1期阻滞作用抑制M FC 细胞的增殖作用, 进而诱导细胞凋亡。G 0/G 1期是细胞周期进程中关键检查点, 细胞周期进程的调节依赖一系列调控因子的有序聚合和激活, 其中G 0/G 1周期相关蛋白cyclin D 是与肿瘤发生、发展关系最密切的细胞周期蛋白之一, 其在多种肿瘤组织中均有过度表达[9], 致癌作用主要表现在协同CDK 对Rb 蛋白磷酸化。周期抑制激酶抑制因子p27k ip1为非特异性G 0/G 1期负调控蛋白, 其低表达或缺失与多种癌症的发生和发展有关, 可抑制cyclinA -CDK 2、cy clinE -CDK 2和cy clinB 1-CDK 2等多种蛋白酶的活性而控制细胞周期G 1-S 的转换。以上研究均提示, 抑制cy clin D/CDK 、提高p27的活性是一种治疗癌症有价值的方法。为进一步研究G -Rh 2影响MFC 细胞周期进程的分子机制, 本研究观察了cyclin D 1和p27kip1的表达情况, 流式细, kip1[10]
104吉林大学学报(医学版) 第34卷 第1期 2008年1月
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以头痛和头晕为主要症状的老年慢性硬膜下血肿诊断体会(附12例报告)
吉林省松原市中心医院放射科(吉林松原138001) 蒋 晶
本科经CT 检查发现12例老年慢性硬膜下血肿, 患者均否认明确外伤史, 仅以头痛、头晕为主要临床表现。因老年人大部分都有高压血、动脉硬化病史, 反应迟钝, 经常出现头痛、头晕, 易被患者忽视而延误病情, 对长期头痛、头晕老年患者行CT 检查可明确诊断。
1 临床资料
老年慢性硬膜下血肿患者12例, 男性11例, 女性1例, 年龄63~82岁。单侧10例, 双侧2例, 多发生于额、颞、顶、枕部位; 呈颅骨内板下新月型、梭型表现, 占位效应较轻, 血肿密度表现为混杂密度2例, 等密度8例、液-液平面2例。根据血肿的大小均有不同程度占位效应, 表现为脑沟受压, 脑血内移, 脑室受压变形, 中线结构轻度移位, 双侧者则中线结构无明显移位。
2 讨 论
硬膜下血肿为出血积聚在硬膜与蛛网膜间硬膜下间隙之内, 多见于冲击伤引起皮质桥静脉撕裂出血形成血肿, 老年慢性硬膜下血肿虽没有明确外伤史, 但一定有反复不自觉轻微外伤, 加之老年人脑血管硬化, 血管脆性增加, 脑组织萎缩, 蛛网膜下腔扩大, 桥静脉张力增高, 当有轻微外伤或者运动过程中慢性作用就有可能发生血管破裂而出血。本组12例慢性硬膜下血肿均以头痛、头晕为主要表现, 无其他神经症状出现。可能由于老年人脑组织萎缩, 蛛网膜下腔扩大, 脑组织相对空间扩大, 使其占位效应不明显, 故产生临床症状较轻微, 易混淆于高血压性脑病等症状, 未引起患者及家属的注意。伤后3周以上为慢性血肿期, 慢性硬膜下血肿较急性血肿范围大, 常发生于额、颞、顶、枕部, 血肿密度变化较大, 一般随病程进展变化从高密度、等密度、低密度、混淆密度伴液-液平面, 等密度慢性硬膜下血肿并不少见, 往往给诊断带来困难。本组有8例有此种表现。等密度血肿并不代表血肿期龄, 有文章指出慢性血肿期的血块发生溶解、纤维蛋白溶解, 使囊内渗透压增高, 脑脊液通过包膜进入血肿内变为等密度。惠国桢等认为, 血液凝固系统与纤维蛋白的溶解系统过度活化, 是慢性硬膜下血肿发生、发展的基本病理因素, 从而导致血肿膜微血管不断出血, 血肿逐渐扩大, 液-液平面的形成则因膨胀增大的血肿牵拉皮质静脉或桥静脉引起静脉破裂而再次出血。出血后新鲜血液细胞成分下沉于血肿间隔内形成的高低密度之间界面呈水平状。因此, 老年人主诉无明显外伤史, 而有头痛、头晕症状时应及时行CT 检查, 可以明确诊断和鉴别诊断。