多糖的分子量与分子量分布测定标准操作规程
目的:
建立多糖的分子量与分子量分布测定的标准操作规程。
2. 依据:
《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3. 范围:
适用于药品中多糖的分子量与分子量分布的测定。 4. 职责:
QC检验员对本标准的实施负责。 5. 程序:
5.1. 对仪器的一般要求:
色谱柱为测多糖专用凝胶柱(按所测样品的分子量大小选择特定排阻范围的凝胶 柱)。检测器为示差折光检测器。
5.2. 系统适用性试验:
按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,规定分析状态下色谱柱的最小理论板数 (n)和供试品在该分析状态下的分配系数(Kd)应达到规定的要求。 Kd =
tR—t0
tT—t0
式中 tR为供试品峰的保留时间;
t0为完全被填料颗粒网孔排阻的大分子的保留时间,一般指蓝色葡聚糖的保 留时间。
tT为能自由进出填料颗粒网孔的小分子的保留时间,一般指葡萄糖的保留时间。 5.3. 测定法:
5.3.1. 系统校正:根据供试品分子量大小,一般选用5个已知分子量的多糖标准品 (常用的为葡聚糖)分别用流动相制成每1ml中约含10mg的标准溶液,分别取上述标准溶液25μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。由GPC专用软件绘制标准曲线,得线性回归方程:
1gMW=a+btR
式中 MW为标样的已知重均分子量; tR 为标样的保留时间。
5.3.2. 样品测量:取供试品溶液25µl注入液相色谱仪,记录色谱图,按下式计算 分子量:
Mn=ΣRIi/Σ(RIi/Mi) Mw=Σ(RIiMi)/ΣRIi D =Mw/Mn 式中 Mn为数均分子量;
RIi为为样品i级分的物质量,即供试品在保留时间i的峰高; Mi为样品i级分的分子量,即供试品在保留时间i的分子量。 5.4. 结果处理:
采用GPC专用软件,可获得供试品归一化色谱图,微分、积分分子量分布图,各 时间点的分子量(片段数据)和各种平均分子量。根据供试品需要选择各项测定结果。
XXXXXXXX 编号:ZL0092 00