实验方案 镧铈对铜胁迫下豌豆种子萌发和生长的影响
1.La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发影响的显效剂量筛选
(1)浓度梯度设计：
LaCl3/ CeCl 3溶液配置：先配置1g•L-1的LaCl3/ CeCl 3溶液母液，然后将母液分别稀释
成浓度为5、10、20、40，60 mg•L-1梯度浓度，调节PH（HCL/NAOH）至6.5，对照(CK)
为PH调节至6.5的去离子水。
重金属Cuso4浓度的设置： 10、25、50、100、200、400 mg•L-1，对照用蒸馏水。
(2)试材培养
种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和
去离子水洗净，常温下晾干备用。
（3）实验设置：CK，La，Ce，Cu（共4组18个浓度57个样品）
（4）试材处理：
选取LaCl3、 CeCl3和 CuSO4各个梯度溶液溶液，豌豆种子经预处理后用各个梯度溶液
浸没处理，对照用蒸馏水，置于25±1℃浸种24h后，将处理后种子均匀排列在直径9cm、
垫有2层滤纸的培养皿中，每处理加入一定量水培养（以没过种子2/3为标准），每处理3
皿重复，每皿20粒。
指标测定方法：
种子发芽第三天测α—淀粉酶，第四天测发芽势，前三天测发芽指数和发芽率，第五天
测量根长、茎长，第六天测根系活力、叶绿素含量、可溶性蛋白质、可溶性糖、SOD、POD、
CAT、MDA.
2． La(Ⅲ)和Ce(Ⅲ)对重金属胁迫下种子萌发及保护酶的影响
(1)试材培养
种子预处理：选取均匀饱满的豌豆种子用0.1%HgCl2溶液消毒15min，分别用自来水和
去离子水洗净，常温下晾干备用。
（2）实验设置：在上一步骤中分别筛选出LaCl3、CeCl3的低剂量、适宜剂量、高剂量
三个有效浓度和CuSO4的一个有效浓度，分别记为A1，A2，A3；B1，B2，B3；C。
（3）实验步骤：有以下几组：
A+C:A1+C、A2+C、A3+C
B+C:B1+C、B2+C、B3+C
A+B+C：A1+B1+C 、A1+B2+C 、A1+B3+C、 A2+B1+C、 A2+B2+C、A2+B3+C、
A3+B1+C 、A3+B2+C、 A3+B3+C
酸盐缓冲液（PBS）配制方法
磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2M）
pH 0.2M Na2HPO4/ml 0.2M NaH2PO4/ml
7.0 61.0 39.0
7.7 89.5 10.5
7.8 91.5 8.5
Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05 0.2M溶液含35.61g/L
Na2HPO4·12 H2O分子量＝358.22 0.2M溶液含71.64g/L
NaH2PO4·H2O分子量＝138.01 0.2M溶液含27.6g/L
NaH2PO4·2H2O分子量＝156.03 0.2M溶液含31.21g/L
0.01M PBS
PBS (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, and 8 mM K2HPO4，pH 7.2)
PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，
KH2PO4 1.4mmol/L
称7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(or 1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于
800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃
冰箱中即可。
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水
0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：
先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的
Na2HPO4, 即可。
然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可，如：
0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
若需要 NaCl的话，加入 NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。
另：其它各种另 PH值的 0.2M PB（100ml)配方 ：
pH 0.2M NaH2PO4（ml） 0.2M Na2HPO4（ml）
7.0 38 62
7.8 8.5 91.5
0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法
称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用
HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034×105Pa)高
压下蒸气灭菌（至少20分钟），保存存于室温或4℃冰箱中。
需要注意的是，通常所说的浓度0.01M 指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度，而非Na 离
子或K 离子的浓度，Na 离子和K 离子只是用来调节渗透压的。如果是用于免疫组化的话，
则需要在配置的时候分别加入100 u/ml青霉素和链霉素之后再调PH、定容、灭菌消毒。
PH 7.6 7.4 7.2 7.0
H2O 1000 1000 1000 1000
NaCl 8.5 8.5 8.5 8.5
Na2HPO4 2.2 2.2 2.2 2.2
NaH2PO4 0.1 0.2 0.3 0.4
PBS缓冲液
称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，
用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用。
0.05mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)的配制：
甲液：0.05mol/L Na2HPO4溶液 ：称取磷酸氢二钠9.465g 7.099g,加蒸 馏水至1000ml ;
乙液：0.05mol/L KH2P04溶液: 称取磷酸二氢钾, 9.07g 6.803g,加蒸馏水至1000m1。
将甲乙液分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即
可得所需pH的缓冲液,见下表:
pH 甲液ml 乙液mI
7.17 70.0 30.0
7.38 80.0 20.0
7.73 90.0 10.0
8.04 95.0 5.0
实验01根系活力的测定（TTC法）
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 分析天平（感量0.1mg）；3. 电子顶载天平
（感量0.1g）；4. 温箱；5. 研钵；6. 三角瓶50ml；7. 漏斗；8. 量筒100ml；9. 吸量管
10ml；10. 刻度试管10ml；11. 试管架；12. 容量瓶10ml；13. 药勺；14. 石英砂适量；
15. 烧杯10ml、1000ml。
（三）试剂：1. 乙酸乙酯（分析纯）。2. 次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉
末。3.1％TTC溶液 准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需
要的浓度。4. 磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。5. 1mol/L硫酸 用量筒取比重1.84的
浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6. 0.4mol/L
琥珀酸 称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。
三、实验步骤
（1）TTC标准曲线的制作 取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许
Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取
此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻
度，即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白
作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等
量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸
2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。
（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出
甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后
加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸
光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]
实验02 脯氨酸含量的测定
（二）仪器设备：1. 722型分光光度计；2. 研钵；3. 100ml小烧杯；4. 容量瓶；
5. 大试管；6. 普通试管；7. 移液管；8. 注射器；9. 水浴锅；10. 漏斗；11. 漏斗架；12.
滤纸；13 剪刀。
（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L
磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中；2. 3％磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏
水溶解后定容至100ml；3. 冰醋酸；4. 甲苯。
三、实验步骤
1. 标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用
少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯
氨酸100μg。（2）系列脯氨酸浓度的配制取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，
1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，
3，4，5及6μg/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml
冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入
4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管
上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/2ml）。
2. 样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。
四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×5/2]/样重（g）。
实验03 叶绿素含量的测定
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。
（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－
6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
实验04植物组织中可溶性蛋白质含量的测定（福林－酚试剂法）
（二）仪器设备：1. 722分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴；4. 定量加样器；5. 冷凝回流装置一套；6. 研钵；7. 离心管；8. 刻度移液管；9. 微量滴定管；10. 试管等；
（三）试剂： 标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使终浓度为250μg／ml；试剂甲；试剂乙。
首先配制A液：4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等比例混合（2%Na2CO3，0.1mol NaOH）；B液：1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等比例混合（0.5%CuSO4·5H2O，0.1%酒石酸钾钠）。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn－酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂（相当于Folin试剂）的配备：称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85%
的H3PO450ml，浓HCl 100ml，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，水50ml，溴水2~3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存（冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min）。使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L H+酸，此为Folin-酚试剂乙液（Folin试剂）。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
三、实验步骤
（一）标准曲线的绘制
1. 取18×200mm试管7支，1～7编号，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg／ml。
2. 用定量加样器给每支试管中加入5ml甲液，混匀，于30℃下放置10min。
3. 再向试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min。
4. 以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定
称取鲜样0.8g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，定容25ml过滤，取滤液1.0ml于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2～4步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。
五、结果计算：
样品中蛋白的含量（mg/g）＝C×VT/（Vs×FW×1000）
式中：C－查标准曲线值（μg）；VT－提取液总体积（ml）；FW－样品鲜重（g）；Vs－测定时加样量（ml）
粗蛋白量（％）＝蛋白氮含量×6.2
实验05 植物组织中可溶性糖含量测定（苯酚法）
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 水浴锅；3. 刻度试管；4. 刻度吸管。
（三）试剂：1. 90％苯酚溶液 称取90克苯酚（AR），加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月；2. 9％苯酚溶液 取3ml90％苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配现用；
3. 浓硫酸（比重1.84）；4. 1％蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000克。加少量水溶解，转入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；
5. 100μg/L 蔗糖标准液 精确吸取1％蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水至刻度。
三、实验步骤
1. 标准曲线的制：向试管内加入1ml9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20S加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在室温下放置30min，比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2. 可溶性糖的提取取：取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份（或干材料），分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
3. 测定 吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的量。
四、结果计算
按下式计算测试样品的糖含量：
可溶性糖含量（％）＝从标准曲线查得糖的量（μg）×提取液体积（ml）×稀释倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量(g)×106]×100
过氧化氢含量的测定
【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算：
CVt
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=FWV1
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）；
Vt—样品提取液总体积（ml）；
V1—测定时用样品提取液体积（ml）；
FW—植物组织鲜重（g）。