PEG诱导原生质体融合的机理：
带有大量负电荷的PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水消失，由于高度脱水
引起原生质体凝集，形成大小程度不同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭曲变形，邻近
原生质体之间紧密接触。
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和PO43-
形成不溶于水的配合物，成为细胞间的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+结合到带负
电磷脂的电离基上，使磷脂分子在膜上相互分离，由此引起融合。
四、实验材料、试剂和仪器
1.材料
无菌烟草叶片、洋葱根尖
五、2.试剂
1）
六、2）
七、
3)PEG液：
30%（w/v) PEG(MW=6000)
CaCl2.2H2O 0.01mol/L
kH2PO4 0.00074mol/L
山梨醇 0.1 mol/L
调pH 5.8-6.2 ；用时现配！
八、2）一般实验用品
大小培养皿，小烧杯，小滴管，刻度离心管，小漏斗，不锈钢网300目.
九、烟草叶肉及洋葱根尖原生质体酶解分离------提纯原生质体并调整原生质体密度--------
.PEG法使原生质体融合--------倒置显微镜观察并照相
实验步骤：
1.取酶储液10ml，分别加入纤维素酶和果胶酶0.08g,0.1g，制备酶液。
2.取材：烟草、洋葱根尖各0.7g
取洋葱根尖，并将其切成0.5cm长短大小放入小平皿中；取烟草叶片将其剪成0.5cm2 大
小放入小平皿中。
3.酶解：将酶液等量加入到存有实验材料的平皿中，放入250c培养箱酶解。洋葱约4h，烟
草约3h。
4.观察酶解效果
4.5.原生质体的分离和纯化
5. 1）酶解后，用300目铜网过滤酶液，去除未酶解的杂质，将滤液收集在10ml离心管
中。
6. 2）1000转/分离心3分钟，用吸管或移液枪弃上清（注意不要把收集的原生质体吸走）。
7. 3）用CaCl2.2H2O （约1ml）悬浮下面的原生质体（PEG法）；电融合法则用电融合
液悬浮。
8. 4）显微镜观察提纯后的原生质体，若杂质较多可重复1）～3）操作。
6.原生质体的密度测定
用血细胞记数板记数。每一样品测定3次，根据测定结果，将悬浮原生质体密度调整至
5*105个/ml。
7.原生质体的融合
（一）PEG法
1）配制PEG液（5ml）
30%（w/v) PEG(MW=6000) 1.5 g
CaCl2.2H2O 0.0074g
kH2PO4
0.0005 g
山梨醇 0.0911g 调pH 5.8～6.2
2）将两种原生质体悬液等量混合
3）用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿7~8滴，每滴约0.1ml。
然后静置10分钟，使原生质体贴在皿底上，形成一薄层（应有3~5个平皿的重复）。
4）用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15分钟。此时可取一
个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。