细胞工程
绪论
1．根据研究对象的不同，细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程。
2．克隆羊多莉的诞生证明了动物细胞核具有全能性。
第一章基本技术
1. 培养基基本成分
大量元素培养基的大量元素使用量一般在每升几十毫克到几千克。
①无机盐类包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S
微量元素微量元素的用量一般低于10-5-10-7克分子浓度。植物所的
微量元素有 Fe、Cu、Zn、B、Mn、Mo、Co
②有机成分：糖、维生素、肌醇、氨基酸、其他
③植物激素：生长素、细胞分裂素
④水：不同实验室要求使用不同级别的纯化水
⑤其它附加成分：琼脂、活性炭、附加复合成分
2. 外植体(explant)：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
外植体的三种来源：①生长在自然环境下的植物
②在温室控制环境条件下生长的植物
③无菌环境下培养的植物
3. 外植体取材总体原则:①根据培养需求选择植物部位
②多年生植物注意树龄和季节
③在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作为外
植体
4. 外植体灭菌顺序：外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水清洗
外植体灭菌后应及时接种培养
5. 外植体培养条件的控制
①光照光照时间影响外植体再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质
研究报道较少
②温度适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量
增加。
③pH 通常使用的pH值范围是5.5—6.5。pH在4.0以下或者7.0以上培养
物就不能正常生长。由于外植体的吸收，引起培养过程中的pH变化；
高压灭菌引起pH值变化
④气体生长量与气体含量关系呈现倒“V”形，折点处的气体含量对应最大生
长量
6. MS培养基适合培养的作物类型：适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为
培养基的基本培养基。N6培养基适合培养的作物类型：特别适合于禾谷类植物的花药和花
粉培养
第二章细胞全能性与形态发生
1. 细胞全能性：一个细胞所具有的产生完整个体的固有能力称之为细胞的全能性。
细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能
性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。
细胞分化：所谓细胞分化（Differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或
潜在发育方式改变的过程。
从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞基因表达与修饰差异
的反应，所以分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的不同表现型。
极性：所谓极性（polarity）是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的
某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建
立的标志。
.细胞脱分化: 培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的始
脱分化的标志。
细胞的脱分化过程可分为3个阶段：①启动阶段：液泡蛋白体出现是启动脱分化的标志。②
演变阶段：此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体。③终结期：细胞回复到分生细
胞状态，细胞分裂即将开始。激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素。
细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同
配合，对细胞分化起着重要调节作用。先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，有利于细胞
分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果两者同时处理，则可促使分化频率
的提高。
器官发生:植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定
根、不定芽等器官的过程。
不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织
上发生的根或芽。
器官发生方式：①先芽后根；②先根后芽；③根芽同步发生。
器官发生过程：①经过愈伤组织的器官发生；②不经过愈伤组织的器官发生。
器官发生的影响因素：①起始材料母体植物的遗传基础和外植体类型及其生理状态；②激素
生长素和细胞分裂素在离体器官分化调控中占有主导地位，CA3、PSK在器官分化中也具有
一定调控作用；③光照光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对
器官分化均有影响；④基因调控
体细胞胚的定义：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似
物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。
体细胞胚的界定：1）体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无
融合生殖胚。2）体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚。3）体细胞经过了胚胎发育
过程，以区别于离体培养中器官发生形成个体的途径。
体细胞胚的形成途径：1）体细胞胚从外植体上直接发生（诱导阶段和胚胎发育阶段）；2）
间接发生经过愈伤组织的体细胞胚形成→经过悬浮细胞的体细胞胚形成；3）愈伤组织诱导
愈伤组织形成→愈伤组织胚性化→球性胚形成→子叶胚期；4）悬浮细胞愈伤组织→胚性愈
伤组织→悬浮培养的胚性细胞团→球性胚形成→成熟子叶胚
影响体细胞胚发生的因素：1）激素的调控作用 2,4-D是应用最为广泛的生长素-球形胚期
形成的生长素极性运输对于体细胞胚的进一步发育尤为重要细胞分裂素在促进细胞分裂，维
持分生组织正常发育具有重要作用 2）培养基及培养条件培养基中的氮源亦会显著影响离
体条件下的胚胎发生，体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。球形胚形成
后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。在胚性愈伤组织形
成后，改用只含1/2MS无机盐浓度的培养基，可显著提高体细胞配的形成率。在体细胞胚
培养后期，降低培养基无机盐浓度，可促进体细胞胚的成熟。3）不同基因型间体细胞胚形
成能力的差异体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异。同类植物的不同基因型，
在体细胞胚诱导的难易、形成时间及单个外植体产生体细胞胚的数量上也存在明显差异。
第三章体细胞遗传变异
1. 体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系。
体细胞无性系变异：由体细胞无性系表现出来的变异。
离体培养中的遗传与变异特点：1）离体培养中的遗传稳定性离体培养的细胞学基础是有丝
分裂，有丝分裂的DNA半保留复制和染色体的均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养
物在一般情况下的遗传稳定性。离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某些变
异，只需根据需要选择适当的培养方式进行离体繁殖，即可以淘汰或选择变异，或分离纯合
体。 2）离体培养下的变异特点变异的普遍性；变异的局限性；嵌合性。 3）影响体细
胞遗传与变异的因素 {供体植物 1、遗传背景：倍性水平：二倍体＞单倍体（稳定性）
基因型：植物种内基因型间变异频率差异较大 2、生理状态外植体：分生组织＞分化组织
（稳定性）} {培养基和培养方式 1、激素培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的
染色体倍性有一定影响。激素引起的变异大多为倍性增加。少数情况下激素引起类减数分裂
而使倍性减少。 2、物理状态一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。
3、培养类型原生质体＞细胞＞组织器官。性细胞＞体细胞} { 继代培养的次数一般来讲，
继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。}
遗传变异分为可遗传变异和非遗传变异。其中非遗传变异：1）外遗传变异：不涉及基因结
构的变化，而只是在基因表达水平上的变异。生长素自养型变异，鸦属植物。2）生理适应
性变异：培养基中硝酸盐的存在引起的培养物硝酸还原酶活性增强，而硝酸盐不存在时，硝
酸还原酶活性又恢复到正常水平。
实验设计题、、、、、、
第四章植物组织细胞培养
1.植物脱毒的定义：利用植物组织培养的方法脱去植物体的病毒
植物脱毒的基本原理：病毒在植物体内的分布具有不均匀性（越靠近生长点，病毒浓度越低）
机理解释：①能量竞争；②传导抑制；③激素抑制；④酶缺乏；⑤抑制因子
植物脱毒的流程:1)母体植株的选择和预处理；2)茎尖分生组织培养再生植株（基本过程：外
植体消毒—茎尖剥离—茎尖培养）----茎尖的剥取剥去生长点（锥）外围的幼叶和叶原基，
露出圆滑的生长锥。剥取茎尖时：迅速（防污染），准确（防损伤生长锥），用显微镜
3)脱毒效果检测指示植物鉴定：指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植
物。血清鉴定：试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定（ELISA）。 4)脱毒苗的保
存与繁殖脱毒苗的离体保存与繁殖建立脱毒种苗生产繁殖网络体系木本植物建立隔离的脱
毒苗母本园
影响脱毒效果的因素：母体材料病毒侵染的程度；外植体的生理状态；起始培养的茎尖大小
2常用的植物脱毒方法有微茎尖培养法、珠心组织培养法和热处理法。
离体无性繁殖：是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。跟常规的
繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁（micropropagation）
植物脱毒时外植体的选择:1)腋芽增殖；2）不定芽增殖；3）体细胞胚增殖；4）愈伤组织增
殖
花药培养：把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，使其发育分化成为支柱的过程。
属于器官培养，获得单倍体。
花粉培养：又叫小孢子培养，从花药中分离出花粉粒，使之成为分散的状态，通过培养，使
花粉粒脱分化进而发育成完整植株的过程。
花药培养的基本程序：外植体选择—外植体预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培
养—分化培养
花粉的发育时期：四分体→小孢子→单核花粉→双核花粉
花药取材时期：单核花粉晚期到双核花粉早期。培养时，蔗糖浓度，10％-12％蔗糖在花药
诱导培养阶段的功能主要是：提供碳源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂
花粉取材时期：四分体到单核花粉早期
花粉的分离方法：1）机械分离法；2）花药漂浮培养自然释放法；3）磁拌法
9.花粉的培养方法：1）直接培养从不经预处理或预培养的新鲜花药中直接分离出花粉粒，接种到培养基中进行培养。 2）预培养将花药在液体培养基中先漂浮培养，然后挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮于液体培养基中进行培养。3）哺育培养。4）看护培养(滤纸起看护作用)
10.根据在培养中所取的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养和子房培养。胚培养包括成熟胚培养和幼胚培养。
11.胚培养在实践中的意义：1）克服杂交育种中杂种胚的早期夭折；2）克服珠心胚干扰，提高育种效率；3）理论研究领域的应用
12.植物胚胎发生过程：原胚—球形胚—心型胚—鱼雷胚—子叶胚
13.植物幼胚培养的关键技术： 1)取材时期大多数幼胚培养成功实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷型胚。以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。 2)幼胚剥离幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。球形胚以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。 3)培养条件的控制剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。
14. 幼胚离体培养的生长发育方式：
1)胚性发育幼胚接种到培养基上以后，依然按照在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成成熟植株。这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株。
2)早熟萌发幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发。在大多数情况下，一个有胚萌发成一个植株。但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
3）愈伤组织在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。
15.幼胚培养条件:1）培养基蔗糖浓度：4-12%，幼胚所处的发育阶段越早，所要求的蔗糖浓度越高。激素：低浓度的GA3和KT能促使幼胚早熟萌发，GA3有时甚至具有胚柄的作用。附加成分：胚乳提取物。 2）光照：培养初期的黑暗条件是必要的。 3）温度：该植物种子萌发的适宜温度为好。
16.悬浮培养：是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
17.愈伤组织诱导要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。选择适宜的培养基：较高浓度激素；必要的附加物质。
18.一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：
1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30-50个细胞以下。
2）均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。
19.悬浮细胞的生长动态：延迟期→对数生长期→直线生长期→减慢期→静止期（在减慢期可进行继代培养，方法是离心，加新鲜培养液）
20.影响悬浮细胞生长的因素：1）起始愈伤组织的质量；2）接种细胞密度；3）培养条件：方式、温度、继代周期
21.细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
22.同步化的方法：分选法；饥饿法；抑制剂法；低温法
23.单细胞培养：1）平板培养；2）看护培养；3）微室培养；4)双层滤纸培养
(6)第五章原生质体培养及杂交
1.原生质体（protoplast）：除去细胞壁的裸露细胞。
2.亚原生质体（subprotoplast）：由于细胞内含物的断裂而形成的较小原生质体。
3.核质体（nuclearplast）：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
4.胞质体（cytoplast）：不含细胞核仅含部分细胞质的原生质体。
5.原生质体的分离：基础材料准备→预处理与酶解→收集与纯化→活力测定
材料预处理: 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。
预处理与酶解: 1) 酶：细胞壁降解酶（酶解时间，酶解温度，酶浓度）2) 渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等
原生质体的收集和纯化：1）沉降法：甘露醇作渗透压调节剂，低速离心，原生质体沉降于管底。2）漂浮法：蔗糖作渗透压调节剂，离心，原生质体漂浮于溶液表面。3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，离心，原生质体处在两液相的界面之间。
原生质体活力测定：1)荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生质体产生绿色荧光。
2)酚藏花红染色法：有活力的原生质体不能被染色。3)荧光增白剂染色法：有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。4）伊凡蓝染色法：有活力的原生质体不能被染色。 影响原生质体活力的因素：1)分离材料的生理状态；2)酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、渗透压；3)分离条件：离心次数、速度等；4)环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
原生质体培养基：1）无机盐：Ca2+、氮源(还原态氨)；2）有机成分；3)激素：生长素先高后低；4)渗透压：培养基渗透压与细胞渗透压等渗；5）PH：5.5-5.9
原生质体培养方法：①液体浅层培养；②固液双层培养；③固液平板培养；④琼脂糖珠培养（摇床振荡；）⑤悬滴培养法；⑥微滴培养法；⑦饲养层培养法
原生质体发育与植株再生过程：1）细胞壁的再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。2）细胞分裂和生长一般原生质体培养2-7天后开始第一次分裂。3）愈伤组织形成大多数情况下原生质体培养2周后形成多细胞的细胞团，6周后可形成小愈伤组织。4）植株再生形成的愈伤组织可转移到分化培养基上一步成苗。 影响原生质体片培养的主要因素：1）基因型；2）原生质体的来源；3)起始培养密度与培养基
植物体细胞杂交：又称为原生质体融合，是指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
植物细胞杂交的类型:1）体细胞杂交；2）体细胞-配子杂交；3）配子间细胞杂交；4）微细胞杂交
原生质体融合的种类：1）对称融合；2）非对称融合
PEG诱导融合法作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，可与带正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；PEG还能增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。优点是成本低；融合子产生的异核率高；不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG对细胞有毒害。
20.影响悬浮细胞生长的因素：1）起始愈伤组织的质量；2）接种细胞密度；3）培养条件：方式、温度、继代周期
21.细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
22.同步化的方法：分选法；饥饿法；抑制剂法；低温法
23.单细胞培养：1）平板培养；2）看护培养；3）微室培养；4)双层滤纸培养
(6)第五章原生质体培养及杂交
1.原生质体（protoplast）：除去细胞壁的裸露细胞。
2.亚原生质体（subprotoplast）：由于细胞内含物的断裂而形成的较小原生质体。
3.核质体（nuclearplast）：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
4.胞质体（cytoplast）：不含细胞核仅含部分细胞质的原生质体。
5.原生质体的分离：基础材料准备→预处理与酶解→收集与纯化→活力测定
材料预处理: 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。
预处理与酶解: 1) 酶：细胞壁降解酶（酶解时间，酶解温度，酶浓度）2) 渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等
原生质体的收集和纯化：1）沉降法：甘露醇作渗透压调节剂，低速离心，原生质体沉降于管底。2）漂浮法：蔗糖作渗透压调节剂，离心，原生质体漂浮于溶液表面。3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，离心，原生质体处在两液相的界面之间。
原生质体活力测定：1)荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：有活力的原生质体产生绿色荧光。
2)酚藏花红染色法：有活力的原生质体不能被染色。3)荧光增白剂染色法：有活力的原生质体随着细胞壁的再生产生绿色荧光。4）伊凡蓝染色法：有活力的原生质体不能被染色。 影响原生质体活力的因素：1)分离材料的生理状态；2)酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、渗透压；3)分离条件：离心次数、速度等；4)环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响
原生质体培养基：1）无机盐：Ca2+、氮源(还原态氨)；2）有机成分；3)激素：生长素先高后低；4)渗透压：培养基渗透压与细胞渗透压等渗；5）PH：5.5-5.9
原生质体培养方法：①液体浅层培养；②固液双层培养；③固液平板培养；④琼脂糖珠培养（摇床振荡；）⑤悬滴培养法；⑥微滴培养法；⑦饲养层培养法
原生质体发育与植株再生过程：1）细胞壁的再生原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。2）细胞分裂和生长一般原生质体培养2-7天后开始第一次分裂。3）愈伤组织形成大多数情况下原生质体培养2周后形成多细胞的细胞团，6周后可形成小愈伤组织。4）植株再生形成的愈伤组织可转移到分化培养基上一步成苗。 影响原生质体片培养的主要因素：1）基因型；2）原生质体的来源；3)起始培养密度与培养基
植物体细胞杂交：又称为原生质体融合，是指将植物不同种、属、甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
植物细胞杂交的类型:1）体细胞杂交；2）体细胞-配子杂交；3）配子间细胞杂交；4）微细胞杂交
原生质体融合的种类：1）对称融合；2）非对称融合
PEG诱导融合法作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，可与带正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；PEG还能增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。优点是成本低；融合子产生的异核率高；不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG对细胞有毒害。