第48卷 第4期
2009年7月
厦门大学学报(自然科学版)
JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)
Vol.48 No.4Jul.2009
L2半胱氨酸作为化妆品美白添加剂的作用机理
杨美花,李智聪,刘凤娇,庄江兴,王 勤,陈清西3
(厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建厦门361005)
摘要:酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是黑色素形成的关键酶,.研究了L2半胱
氨酸(L2Cys)对蘑菇酪氨酸酶和小鼠B16,L2Cys对2种来源的酪氨酸酶有较强的抑制作用,其半效抑制浓度分别为1.B16黑色素瘤细胞粗提的酪氨酸酶的,.进一步对L2Cys在细胞毒性方面进行了研究,结果表明,在200μmol/L浓度下,的生长未显示出明显影响,对细胞状态、代谢MTT的能力、细胞增殖率等均无影响,,为L2Cys作为美白添加剂提供了依据.
关键词:L2;;;B16黑色素瘤细胞
中图分类号:Q356.文献标识码:A 文章编号:043820479(2009)0420581204 黑色素是在黑素小体内合成的一类具有复杂结构、非均质的类多酚聚合体,其量的多少以及分布决定着肤色的深浅,其代谢失调会导致色素沉着性疾病[1].哺乳动物体内,酪氨酸酶首先催化L2酪氨酸羟化成为L多巴(L2DOPA),并进一步催化L2DOPA氧化生成多巴醌,再经过多步酶促和非酶促反应,最终生成黑色素.酪氨酸酶是皮肤黑色素生物合成的关键酶,决定黑色素合成的速率
[1]
1.1 材 料
小鼠B16黑色素瘤细胞购自CTCC;RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;双抗(10000U/mL青霉素、10000μg/mL链霉素)、32(4,52二甲基噻唑22)22,52二苯基四氮唑溴盐(MTT)、胰酶、L2DOPA与蘑菇酪氨酸酶均购自SigmaAldrich公司;L2Cys购自奥伯生物试剂公司.其余试剂均为国产分析纯.
.当前化妆品市场上的美白产品的
主要添加剂如曲酸及其衍生物、熊果甙、抗坏血酸及其衍生物、维生素E、绿茶提取物、甘草提取物等,均是通过抑制酪氨酸酶的活性从而抑制黑色素合成,达到美白的效果[2-4].因此,寻找安全、高效的酪氨酸酶抑制剂成为化妆品添加剂研究的热点.
L2半胱氨酸(L2Cys)是一种含有巯基的天然氨基酸,作为改性剂广泛应用于食品加工领域.近年来,L2Cys作为抗氧剂,在果蔬保鲜领域也有较多研究[5],但
1.2 方 法
1.2.1 L2Cys对蘑菇酪氨酸酶催化L2DOPA氧化反
是L2Cys作为美白化妆品添加剂的作用机理尚未见报道.本文研究了其对黑色素合成的关键酶———酪氨酸酶活力的影响,并对其作为化妆品美白添加剂的可能性进行了研究.
1 材料与方法
收稿日期:2008210231
基金项目:福建省重点科技计划项目(2007N0051),福建省高等学
校新世纪优秀人才支持计划项目资助
3通讯作者:chenqx@xmu.edu.cn
应吸收光谱的影响
采用文献[6]的测活体系,在含有0.5mmol/LL2DOPA,3.33μg/mL酪氨酸酶,0.05mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)的反应体系中,加入不同浓度的L2Cys,30℃下监测酶催化L2DOPA氧化过程吸收光谱的变化情况,波长为230～800nm.1.2.2 L2Cys对蘑菇酪氨酸酶活力的影响
参考文献[6],以L2DOPA为底物,在含不同浓度L2Cys的测活体系中,30℃下分光光度计监测波长为475nm处的光密度值的变化,反应时间为3min,计算酶的活力.1.2.3 小鼠B16细胞酪氨酸酶粗提液的制备
小鼠B16细胞用完全培养基培养(RPMI1640,含10%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100U/mL).细胞裂解方法按照分子克隆介绍的方法[7],并略做修改.小鼠B16细胞在37℃、5%CO2下培养48h,至细胞接近融合状态,37℃下用胰酶消化5min,收集细胞,采用裂解缓冲液(0.25mol/LTris2HCl,p
H
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7.8)对细胞重悬并计数,调整细胞浓度至约2×105/mL,置液氮中速冻1min后置37℃解冻,反复冻融5
次裂解细胞,15000r/min离心10min,上清即为小鼠B16细胞酪氨酸粗提酶液.1.2.4 L2Cys对小鼠B16细胞酪氨酸酶活力的影响B16细胞粗提液酪氨酸酶活性测定采用96孔酶标板测定,在100μL体系(含0.4mg/LL2DOPA和
不同浓度的L2Cys,及恒定量的酶液)中,在30℃下测定475nm的光密度值随时间的增长曲线,从斜率计算酶的活力,产物的消光系数按3700L/(mol・cm)计算.1.2.5 L2Cys对小鼠B16细胞的毒性测定
(1):分别接种于不含L2L的完全培养基中,,4,24和48h)后,显微镜下观察细胞形态贴壁情况有无差异.
(2)代谢MTT能力:小鼠B16细胞接种于96孔板上,培养48h,弃去培养基,换成含0.8mg/mLMTT和不同浓度的L2Cys(0,25,50,100和200μmol/L)的完全培养基继续培养6h,然后,采用细胞裂解液(5mLHCl+50mLTritonX2100,异丙醇定容至500mL)裂解,对照实验为不含L2Cys的完全培养基.使用酶标仪检测,检测波长570nm,参比波长630nm,比较同样细胞浓度下,代谢MTT能力的变化.
(3)细胞增殖率:小鼠B16细胞接种于96孔酶标板上培养6～8h,使细胞贴壁.用完全培养基对L2Cys进行倍半稀释后,考察4个L2Cys浓度梯度(25,50,100和200μmol/L),每个梯度3个重复,对照加入同体积的不含L2Cys完全培养基.使用MTT法检测细胞增殖率,以不含L2Cys的细胞增殖率作为100%[8].
1L2DOPA产物的吸收光谱的
1～6对应的L2Cys浓度分别为0,2,3,4,5,6
μmol/L
Fig.1 EffectofL2Cysontheabsorbancespectraofthe
productofL2DOPAoxidizedbytyrosinase
(图2)表明,随着效应物浓度的增大,酶的活力呈指数
下降,当L2Cys浓度达7.0μmol/L时,酶活力完全丧失.说明L2Cys对蘑菇酪氨酸酶活力有极强的抑制作用,测定导致酶活力下降一半所需要的抑制剂的浓度(IC50)为1.75μmol/L.
图2 L2Cys对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用
2 实验结果
2.1 L2Cys对蘑菇酪氨酸酶催化L2DOPA氧
Fig.2 InhibitoryeffectsofL2Cysontheactivityofmush2
roomtyrosinase
化反应吸收光谱的影响
在不含L2Cys的测活体系中,酶氧化反应的产物
在475nm处有一个特征吸收峰,随着L2Cys浓度增大,该吸收峰明显下降,当L2Cys浓度达6.0μmol/L时,该特征吸收峰完全消失(图1),说明L2Cys对酪氨酸酶的活力有明显的抑制作用.
2.3 L2Cys对小鼠B16细胞粗提液酪氨酸酶
活力的影响
研究L2Cys对小鼠B16细胞中酪氨酸酶活力的影响,含有0.5mmol/LL2DOPA为底物、不同浓度的L2Cys为效应物的测活体系中,加入恒定量的小鼠B16细胞酶提取液,30℃下测定波长为475nm的光密度值随时间的变化曲线,结果见图3a.当反应体系中加入了L2Cys时,酶反应的动力学曲线发生了改变(图3a曲线1～6),表现为迟滞时间的延长和初始稳态速度的下降.测定不同浓度的L2Cys
对酶反应的迟
2.2 L2Cys对蘑菇酪氨酸酶活力的影响
研究L2Cys对蘑菇酪氨酸酶活力的影响,在含有0.5mmol/LL2DOPA的测活体系中,加入不同浓度的L2Cys为效应物,研究其对酶活力的影响.
结果
第4期杨美花等:L2半胱氨酸作为化妆品美白添加剂的作用机理・ 583・
滞时间和稳态速度的影响,结果分别见图3b和图3c,
显示L2Cys不仅能够延长酶反应的迟滞时间,又降低了酶的稳态速度.当L2Cys浓度小于6μmol/L时,随着L2Cys浓度的增大,迟滞时间明显延长,当L2Cys浓度为6μmol/L时,迟滞时间延长到2252s,而酶的稳态活力仅下降7.42%,说明L2Cys主要通过延长反应的迟滞时间而表现其抑制作用;当L2Cys浓度继续升高,迟滞时间进一步增加,同时酶反应的稳态速度则随着L2Cys浓度的增大而呈指数下降,当效应物浓度达18μmol/L时,酶初始速度下降到43.5%,其半效抑制浓度约为15μmol/L.表明浓度较高时,L2Cys不仅影响延长酶反应时间
,.
示L2Cys对小鼠B16细胞无毒性,对该细胞是安全的.
3 讨 论
本文使用紫外光谱法快速证明了L2Cys对蘑菇酪氨酸酶的活力有抑制,实验显示,L2Cys对酪氨酸酶有着显著的抑制作用,其抑制效果具有剂量依赖性,其IC50为1.75μmol/L;LB16细胞的酪氨酸酶研,L2,.当L2Cys浓度时,L2Cys主要通过延长反应的迟滞时;当L2Cys浓度大于6μmol/L时,L2Cys不仅延长迟滞时间,而且明显降低酶的稳态速度,显示出双重的抑制作用.
关于L2Cys对酶活力的影响,基本上有2种说法:(1)硫醇类化合物可以结合酶活性中心的铜离子从而抑制酶的活力;
(2)硫醇类化合物可以在酶促反应过程中与生成的产物醌发生一快速的非酶催化反应而结合形成一种稳定的无色化合物[9].根据我们的研究结果,上述两种作用同时存在,迟滞时间明显延长,表明L2Cys结合了酶促反应产物,生成了无色物质,使酶不表现出活性;L2Cys也可以降低酶的稳态活力,说明L2Cys可以和酶的活性中心不可逆地结合,从而抑制了酶的活性.
L2Cys细胞毒性检测结果说明,在200μmol/L的浓度下,L2Cys对B16细胞的细胞状态、增殖率、代谢能力等均无影响,从细胞水平上证明了L2Cys作为美白添加剂是安全的.
图3 L2Cys对小鼠B16细胞酪氨酸酶的抑制进程曲线(a)
及对酪氨酸酶迟滞时间(b)和稳态活力(c)的影响曲线1～6抑制剂浓度分别为:0,2,4,6,12和18
μmol/L
Fig.3 (a)Progresscurvesfortheinhibitionoftyosinase
frommouseB16melanomacellsbyL2Cys;(b)and(c)denotetheeffectsofL2Cysonthelagtimeandonthesteady2stateactivityoftheenzyme,respec2tively
参考文献:
2.4 L2Cys对小鼠B16细胞毒性检测
研究不同浓度的L2Cys(0,25,50,100和200μmol/L)对小鼠B16细胞毒性,处理不同时间(0,2,4,6,12,24和48h)后,显微镜下观察B16细胞无异常变化,4～6h后均贴壁完全.在培养过程中定期观察,细胞呈典型的贴壁细胞特征,单层生长,略呈长梭状,细胞质呈半透明,无异常颗粒或膨胀、缩小、变形,这些现象均与对照组相一致,说明L2Cys对小鼠B16细胞的生长没有影响.调整细胞浓度为5×105/mL,以正常细胞代谢MTT的能力为100%,分别测定不同浓度(25,50,100和200μmol/L)的L2Cys处理的后的MTT代谢能力水平,测定结果分别为:97%、107%、103%、96%,经在不同浓度L2Cys处理的小鼠B16细
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StudyontheWhiteningYANGMei22jiao,ZHUANGJiang2xing,
GQin,CHENQing2xi3
(KeyLaboratoryofEducationforCellBiologyandTumorCellEngineering,SchoolofLifeSciences,
XiamenUniversity,Xiamen361005,China)
Abstract:Tyrosinase(EC1.14.18.1)isakeyenzymeinvolvedinthemelaninbiosynthesis.Nowadays,tyrosinaseinhibitionhasbe2
comeahotspotonresearchofwhiteningcosmeticadditive.Inthispaper,theeffectsofL2cysteine(L2Cys)ontheactivityoftyrosinasefrombothmushroomandmouseB16melanomacellswerestudied.TheresultsshowedthatL2CyscouldremarkablyprolongthelagtimeandinhibittheactivityoftyrosinaseextractedfromB16cells,andtheconcentrationforL2Cysleadingto50%tyrosinaseactivitylost(IC50)was1.75μmol/Land15μmol/L,respectively.Furthermore,thecellstoxicityofL2Cyswereassessed.TheresultsshowedthatL2Cyshasnoobviousinfluenceincellularmorphology,growthrate,metabolismofthiazoleblue(MTT)ofB16melanomacells,indicatingthatL2Cysissafeforusingasapotentialcosmeticadditive.ThisresearchprovidedabasisfortheusageofL2Cysaswhit2eningcosmeticadditive.
Keywords:L2cysteine;melanogenesis;tyrosinase;B16melanoma
cell