山东农业科学
数粒仪http://www.agri50.cn/
2007年 第6期
花生种子脂肪氧化酶同工酶鉴定研究
陈 静, 苗华荣, 石运庆, 宋丽花, 禹山林
1
1
1
2
1
(11山东省花生研究所, 山东青岛 266100; 21临沭县农技站, 山东临沭 276600)
摘 要:根据花生种子脂肪氧化酶同工酶等电点差异, 利用等电聚焦电泳技术, 对不同品种花生种子脂肪氧化酶同工酶进行鉴定分析。结果表明:(1) 花生种子脂肪氧化酶同工酶有4条带, 其等电点分别为pH6135、pH 7100、pH7146、pH 7174; (2) 不同品种花生种子脂肪氧化酶的I EF -PA G E 图谱有差异, 其中三份材料呈现4条酶带, 其它材料呈现3条酶带; (3) 相同类型不同品种种子脂肪氧化酶的电泳图谱不同。
关键词:花生; 种子; 脂肪氧化酶; 等电聚焦电泳
中图分类号:S56512; Q 554 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2007) 06-0018-03
脂肪氧化酶(Lipo xyg enase 1Lox 1EC I 113111112) 系统命名为Lino leate :ox yg en ox-i der eductase, 即亚油酸氧化还原酶, 广泛存在于高等植物体内, 是脂质降解过程中的一个关键酶类, 主要催化包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸在内的由亚甲基间隔的不饱和脂肪酸的加氧反应, 生成具有共扼双键的脂肪酸氢过氧化物。脂肪氧化酶与生长、发育、成熟、衰老以及抗病虫等各种生理及病理代谢过程密切相关[1~4], 不同部位脂肪氧化酶参与生理过程是不同的, 而相同部位各同工酶的生理功能也有差异。水稻叶片脂肪氧化酶参与叶部病理代谢过程, 种胚脂肪氧化酶与耐储藏性密切相关; 大豆种子脂肪氧化酶与优质加工密切有关。Sanders 等研究认为花生脂肪氧化酶的同工酶有三种, 它们多以不饱和脂肪酸为底物, 氧化形成9-脂氢过氧化亚油酸(9-H PODE) 、13-脂氢过氧化亚油酸(13-H PODE) 或两者不同比例的混合物
[5]
1 材料与方法
111 材料与试剂
13份花生品种由山东省花生研究所和印度国际半干旱研究所提供, 为多粒型的栖霞糠皮三
粒红, 珍珠豆型的白突9号、06-1、ICG92196、ICG92206, 普通型的non -nod 、牟平兔子墩、8130、郯城睡果子, 中间型的P86、A 1SPDB 、8126及野生种A 1SP 。
亚油酸(纯度为99%) 、邻联茴香胺由Sig ma 生产; 两性电解质(pH 3~915, 纯度40%) 、亲和硅烷由Pharmacia 生产; 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、T EMED 为Am resco 生产, 超纯级; 剥离硅烷为北京鼎国生产。112 试验方法
根据文献[6]方法, 略做修改。
11211 样品制备 吸取011m ol/L 、pH 713~715的Tris-CaCl 2提取液018ml, 加入400mg 磨细的花生粉中, 冰浴研磨后转入Eppendor f 管中, 振荡均匀, 置于4e 下提取015h, 12000@g 冷冻离心20m in , 取上清液备用。11212 凝胶制备 ¹凝胶溶液:715%聚丙烯酰胺凝胶溶液(2911%Acr +019%Bis) , 312%Am -pholine (pH 310~915) , 01067%AP 和011%TEM ED 。º灌胶:为使凝胶粘贴在下层板上, 预先在玻璃板上涂布0112%Bind-Silane 涂料2ml, 为不使凝胶粘贴在上层板上, 预先在玻璃板
。目前有关花生种子脂肪氧化酶的分
析研究主要通过酶活性测定。我们根据花生种子脂肪氧化酶同工酶等电点差异, 利用等电聚焦电泳技术(IEF -PAGE) , 建立了花生种子脂肪氧化酶的IEF 鉴定方法
[6]
。本研究利用我们建立的
鉴定方法, 对不同品种花生种子脂肪氧化酶同工酶进行鉴定分析, 从而为深入研究花生种子脂肪氧化酶的生理功能奠定基础。
收稿日期:2007-06-21
基金项目:山东省农业科学院青年基金项目(2005YQ005) ; 山东省良种工程/高产优质出口专用花生新品种培育0项目。作者简介:陈 静(1976-) , 女, 山东兖州人, 助理研究员, 硕士, 主要从事花生遗传育种研究。
上均匀涂布10%Repe-Silane 涂料2m l 。在下层玻璃板两边各放一根隔条, 然后把另一块玻璃板放在上面, 用夹子夹住两块玻璃板, 凝胶溶液倒在上下玻璃板之间的空隙中, 室温放置待胶凝固后放入4e 冰箱备用。
11213 IEF 电泳 样品直接加在薄层胶片上的加样纸上, 加样量约10L l, 通冷却水电泳。电泳程序:¹60V, 15m in; º7m A 稳流, 电压上升到600~700V; »600V 稳压, 30m in 后, 关掉电源, 打开安全罩, 用镊子取出加样纸; ¼600V 稳压电泳215h, 结束电泳。
11214 染色 ¹将凝胶板在磷酸缓冲液中(011mol/L, pH 714) 浸泡5min 。º将凝胶板转移至酶染液中, 26~28e 下酶染过夜。酶染液的配制:A 液:称取15m g 邻联茴香胺溶于7ml 无水乙醇中; B 液:吸取150L l 亚油酸溶于016ml 无水乙醇中, 再加019ml Tw een20; A 与B 两溶液混合后, 再用011m ol/L 磷酸盐缓冲液(pH 714) 定容至150ml; »将凝胶板用磷酸缓冲液和脱色液各洗一次, 每次5min; ¼凝胶板再进行考马斯亮蓝蛋白质染色15min 。蛋白质染色液的配制:称取0119g 考马斯亮蓝R250, 加入150m l 脱色液(甲醇B 冰醋酸B 水=3B 1B 6) , 边搅拌边水浴加热至50~60e , 使其充分溶解, 过滤使用; ½最后用脱色液洗脱凝胶板数次, 使酶带清晰显色。11215 等电点的测定 电泳结束后, 将未加样一
侧的凝胶用双蒸水洗净, 按酸端到碱端的顺序切
成015cm 的小段, 各自浸入抽气后装有113m l 双蒸水的Eppendor f 管中过夜, 次日用酸度计分别测定各段的pH 值, 以凝胶长度为横坐标, pH 值为纵坐标绘制曲线, 由酶带的位置找出相对应的pH 值即为该谱带的等电点。
2 结果与分析
211 试验条件的研究分析
本研究针对花生种子脂肪氧化酶的适宜提取和酶染条件进行了大量试验摸索, 确定了提取花生种子脂肪氧化酶各同工酶的适宜pH 值为713~715, 冰浴提取效果优; 酶染温度26~28e , 振荡条件下染色过夜, 酶染缓冲液为pH 714的磷酸盐缓冲液。212 不同品种花生种子脂肪氧化酶的电泳图谱分析
花生种子脂肪氧化酶同工酶有4条带, B 、C 、D 清晰可见, A 显弱带(图1) ; 4条带差异明显, 它们的等电点分别为:pH 6135、pH 7100、pH 7146、pH 7174。
由图1可以看出, 通过酶活性染色和考马斯亮蓝染色, 不同品种花生种子脂肪氧化酶的电泳图谱是有差异的。栖霞糠皮三粒红、郯城睡果子、A 1SP 三个品种呈现A 、B 、C 、D 4条酶带, 其余10个品种呈现B 、C 、D3
条酶带。相同类型不同品种
A.
花生品种种子脂肪氧化酶活性染色
B. 花生品种种子脂肪氧化酶考马斯亮蓝染色
1、栖霞糠皮三粒红; 2、白突9号; 3、n on-nod; 4、牟平兔子墩; 5、06-1; 6、P86; 7、A 1SPDB; 8、ICG92196; 9、ICG92206;
10、8126; 11~13、17、A 1SP; 14~16、8130; 18、郯城睡果子
图1 IEF-P AG E 图谱(阳极在上, 阴极在下)
种子脂肪氧化酶的电泳图谱不同, 郯城睡果子、牟平兔子墩、no n-no d 和8130均为普通型品种, 郯城睡果子为4条酶带, 其他3份品种则呈现3条酶带。A 1SPDB 是由A 1SP 加倍获得的, 二者种子脂肪氧化酶的电泳图谱不同, A 1SP 比A 1SPDB 多一条等电点略偏酸性的A 酶带, 其他3条两者均有, 但A 1SPDB 的酶带B 、D 带显色略浅。
豆为615、710和910; 而花生脂肪氧化酶酶活性
比大豆的低。因此, 本试验在借鉴大豆脂肪氧化酶鉴定方法的基础上, 经过反复试验确定了花生种子脂肪氧化酶适宜的提取条件、酶染条件和两性电解质pH 范围:提取液pH 713~715, 冰浴提取; 酶染缓冲液为pH 714的磷酸盐缓冲液, 酶染温度26~28e , 振荡条件下染色过夜。本试验选用的两性电解质pH 为310~915, 而4条谱带等电点在pH 6135~7174间, 因而下一步选用两性电解质的pH 范围, 可适当缩小至4~8之间) , 以提高酶带的分辨率。参 考 文 献:
[1] Feus sner I, Kh n H , W asternack C 1Lipoxygenase 2de -pendent degradati on of storage lipids [J ]1T ren ds Plant
Sci 1, 2001, 6(6) :268-2731
[2] Siedow J N 1Plant lipoxygenase:s tructure and function[J ]1
Annu 1Rev 1Pla 1Ph ysiol 1Plan t M ol 1Biol 1, 1991, 42:145-1881
[3] Robins on D S , Wu Z, Domoney C, et al 1Lipoxygenases
an d the quality of foods [J ]1Food Chem 1, 1995, 54:33-431
[4] 沈文飚, 郑天清, 万建民, 等1胡萝卜素漂白法快速筛选耐
储藏水稻品种[J]1中国水稻科学, 2003, 17(4) :387-3881[5] S and ers, et al 1Lipoxygenas e is ozymes of peanut [J ]1Lip -ids 11975, 10(11) :681-6851
[6] 陈 静, 石运庆, 吴兰荣, 等1花生种子脂肪氧化酶鉴定方
法研究[J]1花生学报, 2006, 3:6-91[7] Oh ta H , Ida S, M ikam i B, et al 1Purification an d Charac -terization of Rice Lipox ygenase Component 3from Emb ry -os[J]1Agri 1Biol 1Chem 1, 1986, 50(12) :3165-31711
[8] 傅翠真1大豆脂肪氧化酶的鉴定方法[J]1大豆科学, 2004,
2:15-171
[9] 丁安林, 傅翠真1大豆脂肪氧化酶同工酶的鉴定研究[J]1
作物学报, 1995, 20(3) :373-3741
[10]丁安林, 张 艳, 常汝镇, 等1大豆脂肪氧化酶研究进展[J ]
1大豆科学, 1995, 14(1) :67-731
[11]Barnes P, Galliard T 1Ran cidity in cereal produ cts[J]1Lipid
Techn ol 1, 1991, 3:23-281
3 结论与讨论
等电聚焦电泳技术是一种根据样品的等电点
不同而使它们在pH 梯度中相互分离的一种电泳技术, 具有分辨率高、特异性强、重现性好等特点。本研究结果表明, 花生种子脂肪氧化酶同工酶有4条带, 等电点分别为:pH 6135、pH 7100、pH 7146、pH 7174。等电点差异明显, 酶活性高, 通过该技术鉴定分析花生种子脂肪氧化酶同工酶完全可行。
以亚油酸为底物, 根据产生氢过氧基手性和位置专一性的不同, 植物LOX 可分为三种类型[7], 但本研究所得4条酶带的产物尚不清楚, 暂以A 、B 、C 、D 来表示。
根据不同品种花生种子脂肪氧化酶酶带数量的差异, 可以将供试品种分为两类:一类呈现4条酶带, 即A 、B 、C 、D 4条酶带均具有; 另一类呈现三条酶带, 仅含有B 、C 、D 3条酶带, 两类品种的区别在于酶带A 的有无, 酶带A 有何特定生理功能尚需深入研究。A 1SPDB 是A 1SP 经加倍处理后的种质, A 1SPDB 缺少酶带A, 且酶带B 和D 显色略浅, 原因有待从分子水平深入探讨。
花生种子脂肪氧化酶与大豆相比, 在酶活性和酶活性最适pH 值上均有较大差异[5, 8~11], 花生脂肪氧化酶酶活性最适pH 值为612和813, 大(上接第13页) 稳定, 生根培养10d 左右即自动分解有关, 因为在这段时间里, 它诱导形成了根原基, 这对根的伸长生长极为有利; 但根原基形成后, 若培养基中仍然存在着较高浓度的生长素, 就会抑制根原基的伸长生长。
河沙和炉灰渣是毛地黄试管苗移栽和扦插的理想基质, 与这两种基质通气性好有关, 这说明充足的氧气供给是移栽与扦插毛地黄试管苗根系生长非常重要的条件。参 考 文 献:
[1] 中国植物志编辑委员会主编1中国植物志[M]1北京:科学
出版社, 1997, 2121
[2] 中国科学院植物研究所主编1中国高等植物图鉴[M ]1北
京:高等教育出版社, 1974, 521
[3] 姜长阳1培养基琼脂用量的商榷[J]1植物生理学通讯,
1990, 2:53-541
[4] 安利佳, 姜长阳1植物组织培养导论[M ]1大连:辽宁师范大学出版社, 1993, 55-581
[5] 王翠杰, 刘丽君1影响樱桃砧木试管苗生根的因素[J]1北
方果树, 2000, 1:151
[6] 施和平, 权 宏1紫花毛地黄组织培养和植株再生[J]1中
草药, 2004, 36(3) :327-3281
[7] 冯 敏, 毛学文, 陈 荃1不同光质和培养基对毛地黄叶组
织培养中强心苷积累和效应研究[J]1韶关大学学报(自然科学版) , 1994, 4(10) :70-731