实验七 流式细胞仪测A549细胞周期
实验原理：细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂
结束为止的活动过程，分为间期与分裂期（M 期）两个阶段。间期又分为三期即DNA 合成前期（G1期）、DNA 合成期（S 期）与DNA 合成后期（G2期）。用流式细胞仪检测细胞周期通常用PI 染细胞核，PI 在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA 含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。
实验用品：
（1） 材料：A549细胞
（2） 试剂：培养液、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、1×PBS(PH=7.4)VB
（3） 设备：微量加样器、小烧杯、超净工作台、CO 2孵育箱、倒置相
差显微镜。
试剂配制：PI ：碘化丙啶，以PBS 配成1mg/ml，4℃保存。
RNaseA ：10mg/ml
实验分组：空白对照0umol/L
处理组：10、20、40、80umol/l,
每浓度两个平行瓶。
实验步骤：
（1）取对数生长期的细胞EDTA+胰酶消化至单个细胞悬液。计数。
（2）取小方瓶，每瓶加4ml 培养液约接种20万个细胞（理论可以20~50万），
过夜待贴壁。
(3)每瓶加入相应浓度的处理因素，（终浓度为0、10、20、40、80umol/L）继续
培养48小时。
（4）取离心管做好标记，将上清液转入离心管中。
（5）加胰酶消化之单个细胞（不用EDTA ），弃消化液。
（6）将离心管的的液体重新倒入相应的小方瓶中，吹匀。转离心管。
（7）离心1000转10min. 弃上清。
（8）加适量PBS(5~10ml)吹匀。离心1000转10min 。弃上清。
（9）重复（8）
（10）加入2.5ml 的酒精悬浮细胞。放4℃冰箱至少30min ，或过夜。
(11) 1000g离心5min, 弃上清。
(12)加PBS ，1000g 离心5min 弃上清。
（13）加500ulPBS 重悬细胞。转流式管。
（14）加PI 、RNA 酶各5ul 。（0umol/l的留一个不加）37℃，30min 。避光。
（15）上机检测。
凯基细胞DNA 含量检测试剂盒（细胞周期）
(Cell Cycle Detection Kit)
Cat number：KGA For Research Use Only
Store at 4℃ for one year
Expire date：
一、 试剂盒说明
细胞周期（cell cycle）是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期又可以分为间期（interphase ）和有丝分裂期(M phase)，细胞间期又常划分为休眠期（G0）,DNA 合成前期（G1），DNA 合成期（S ），DNA 合成后期（G2），整个周期可表示为G1→S →G2→M 。DNA 周期检测可用来反应细胞周期的各个期的状况，即细胞增殖状况。利用细胞内DNA 能够和荧光染料（如碘化丙啶--PI ）结合的特性，细胞各个时期其DNA 含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样。
细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射
0性质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对90角光散射
0的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向角和90角光散射的信号均降低。因此可
通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察凋亡细胞。用 PI对细胞进行染色，凋亡细胞由于总DNA 量降低，于正常G 0/G1细胞群前出现一DNA 低染细胞群，即G 1峰前出现亚二倍体峰（sub-G 1），细胞凋亡群。
本试剂盒可应用于培养细胞（悬浮、贴壁）的DNA 含量（细胞周期）检测。
二、试剂盒组份
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
流式细胞仪、低速离心机、微量移液器、1.5m L Microtube、70％乙醇、PBS
四、使用注意事项
1． 微量试剂取用前请离心集液。
2． Propidium Iodide （PI ）避光保存及使用，PI 有毒，操作时请戴手套。
五、操作方法
1． 用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；
2． 用PBS 洗涤细胞一次（离心2000rpm ，5min ）收集并调整细胞浓度为1×10/ml；
3． 制备的单细胞悬液用体积分数为70％乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗
去固定液；
（如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次）；
4． 加100μL RNase A 37℃水浴30min ；
5． 再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30min ；
6． 上机检测，记录激发波长488nm 处红色荧光。
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