() 颈动脉狭窄动物模型制作的研究进展
中南大学湘雅医院神经内科(410008) 刘恒方 黄晓松 刘尊敬 综述 杨期东 审校
摘 要:颈动脉狭窄动物模型制备的方法很多, 包括颈动脉外膜植入硅橡胶圈法、球囊损伤法、电刺激法、空气造模法及外科手术线扎法等, 但是不同模型的颈动脉狭窄形成的机制及病理各有其特点, 而且研究的侧重点也存在着差异。本文重点介绍颈动脉狭窄动物模型的制作方法及其优、缺点。关键词:颈动脉狭窄; 动脉粥样硬化; 斑块; 动物模型
缺血性脑血管病是当今世界上发病率和病死率最高的三大疾病之一, 是首位致残因素, 对缺血性脑血管的发病机理研究是当今的研究热点, 其中颈动脉狭窄也是缺血脑血管病的原因之一, 建立稳定可靠的动物模型是研究的重要环节, 目前颈动脉狭窄动物模型制作方法及动物种类多种多样, 地选择动物及制作方法, [1, 2死。
1. 4 狗
属于犬科, , 但是狗, 因此较难模。
1与人类同属灵长类动物, 可以发展成与人类相同的动脉狭窄, 是较为理想的动物, 但是制作模型的周期长, 费用较高, 饲养也有诸多不便、价格昂贵、后期检测的指标试剂较难获得, 多需要重新合成, 且为保护性动物。
2 颈动脉狭窄建立的方法
、动物的选择、、缺点进行详细的阐述。
1 动物的选择
目前用于颈动脉狭窄动物模型的动物较多, 常见的实验动物有
1. 1 兔
[3, 4, 18]
:兔、大鼠、猪、犬及猴。
实验动物的颈动脉狭窄自然发病率非常之低, 能模仿人类的动脉硬化斑块而致的颈动脉狭窄自然发生率更低, 因此常常需要人为的干预, 所以建立和人类相似的、既要局部的动脉狭窄, 又要满足动脉内膜病变部位固定, 成为颈动脉狭窄模型的关键所在。制作颈动脉狭窄模型的方法很多, 主要有颈动脉外膜植入硅橡胶圈法、球囊损伤法、电刺激法、空气造模法及外科手术线扎法、浸泡肉毒素的线及药物诱导法等。
2. 1 硅橡胶圈法
兔颈动脉较粗, 手术视野大且易于辨认, 便于操作、分离颈动脉, 可以肉眼直视下手术, 兔也是素食动物, 高胆固醇喂养容易产生富含脂质的动脉硬化变化、兔生命力强, 价格低廉、易获得、制作模型所需周期短、属于封闭群动物, 但是兔颈动脉的三层分界不十分清楚, 动脉壁薄, 过高胆固醇饲养易消瘦而致抵抗力低下。
1. 2 大鼠
模型制作经济、容易获得, 价格低廉, 针对后续测定指标的试剂较多, 便以饲养, 手术耐受性好, 但是模型颈动脉较细需使用显微镜, 手术视野小不便于操作, 喂养较难产生动脉硬化
[5, 18]
将一个柔软的硅橡胶圈放置于兔颈动脉周围诱导动脉内膜增厚, 硅橡胶圈放置的动脉段被认为是动脉粥样硬化斑块形成的好发区域。
Soma 等
[4]
。可喜的是目前有采所描述的基本方法:动物麻醉后, 使动
用基因敲除鼠制作动脉狭窄的模型, 其针对性较强、特异性高, 可能为将来的发展方向。
1. 3 猪
物背侧卧位, 在兔子颈部做一正中切口, 分离双侧颈动脉, 将一个非闭塞的、无生物活性的、柔软的、空心的硅橡胶圈放置于双侧颈动脉周围。硅橡胶圈1. 5
cm 长, 只有两端圆周接触颈动脉周围, 两端间距离为1. 0cm 。其中一侧颈动脉放置的硅橡胶圈, 在缝合切
可以制作成和人类相似的动脉硬化和狭窄的模型, 但是饲养费用高, 饲养难度大, 另外容易发生猝
收稿日期:2005206223; 修回日期:2005212206
() 作者简介:刘恒方19652, 男, 博士在读, 主要从事脑血管病的研究。
口前被取出, 该侧称为伪手术侧。Meyer 使用不同形状的硅橡胶圈植入双侧颈动脉, 实验1组的每只动物双侧颈动脉外膜均植入密闭型硅橡胶圈(1型硅橡胶圈) , 左侧颈动脉为伪手术侧; 实验2组植入的硅橡胶圈壁的75%(2型硅橡胶圈) 被去除, 留下2条带连接硅橡胶圈的边沿(称为开口型硅橡胶圈) 。伪手术侧也分离周围的连接组织和迷走神经, 使之接受相同的牵拉, 这些区域分别被看作内部控制域。硅橡胶圈放置于颈动脉外膜后, 其开口处使用医用硅胶封闭, 尽可能使用最小剂量的胶, 避免医用胶和和颈动脉外膜的接触, 防止医用胶引起血管层面的α2平滑肌细胞的纤维蛋白局部缺失。植入好硅橡胶圈后, 将颈动脉放回原位置, 缝合切口。兔给于标准的实验室喂养, 硅橡胶圈留置14d 。
采用硅橡胶圈制作模型的方法所需的时间报道差异性较大, Booth 等
[15]
[7]
──直流电脉冲(15m s /i m pulses, 0. 1mA , 10Hz ) , 每天使用一个外刺激单元刺激颈动脉, 每只模型动物刺激28d 为一个周期, 频率为每天间隔8～10h 刺激一次, 每次刺激15～30m in, 将小塑料插座置于颅骨上是为了电刺激时动物能随意活动。电刺激的同时, 还要给动物0. 2%高胆固醇饮食, 以便产生动脉粥样硬化斑块。电刺激和高胆固醇喂养动物28d, 结果显示, 最大的粥样硬化斑块位置位于刺激电极的阳极下方, 电刺激产生的动脉硬化斑块的优点为既保持血管内皮细胞排列的完整性又能产生动脉硬化斑块, 但是该模型产出的颈动脉狭窄的程度仅在50%以下。有作者为了增加颈动脉狭窄程度, 采用电刺激, 这样使得该模, 程、耗时长, 因此该方。
硅h 开
的颈动脉外膜, 7d 建造局部缺血区。[16]
制作方法
[12214]
:兔麻醉后, 穿刺针从右侧股动脉
始, , h 达高峰, 24h 开始下降, 24h 向腔内迁移。植入3d 后可检测到平滑肌细胞增生, 大多数多核细胞消失。硅橡胶圈植入7d 后, 多核白细胞则完全消失。在2周内产生具有良好特征的、重现内膜损害的动物模型, 其主要成份为增生的平滑肌细胞。该模型动脉病理变化能重现人类动脉硬化发生、发展的病理过程, 譬如炎症过程、内皮细胞活动、内膜增厚, 以及随后发生的细胞迁移和平滑肌细胞增生。但是该模型病理学机理尚不完全清楚, 推测与下列因素有关:炎性反应、低氧导致的血管中层缺氧、血管周围神经网络损害、颈动脉血管痉挛而致的血流动力学的改变等。尽管硅橡胶圈为非完全接触血管外膜的刺激物, 但仍可能导致血管收缩, 因此血管痉挛也可能是其形成颈动脉狭窄的主要机制之一。文献中没有标准的硅橡胶圈规格譬如硅橡胶圈的形状、直径、两端的距离与血管接触的压力, 可能正是由于植入硅橡胶圈的差异导致不同的实验室结果各异。本模型的最大优点就是动脉狭窄好发区域较为固定且所需时间较短, 能较好重现人的颈动脉狭窄的病理过程, 而且不间断动脉血管内皮细胞层, 平滑肌细胞损害的较小。
2. 2 直流电刺激颈动脉外膜法
穿刺成功后, 用0. 014导丝把内径为3. 5mm 、长为
15mm 的球囊导管送入颈动脉动脉, 8个大气压充盈
球囊, 反复回拉球囊损伤动脉内膜3次, 造成血管内皮细胞及平滑肌层损害。有作者联合7d 的高胆固醇喂养, 使之形成颈动脉狭窄模型。Chekanov 将暴露的颈动脉血管结扎, 结扎长度至少3cm , 在直视下直接切开动脉, 导引球囊导管。球囊每间隔30s 扩张一次, 每次球囊扩张使用6个大气压、持续30s, 拔出导管后, 采用7～0号聚丙烯缝合线缝合动脉小切口, 颈动脉血流重新恢复, 所有动物均未接受肝素或抑制血小板聚集的药物。有作者
[9]
[8]
在颈正中切口暴
露并游离右颈总动脉、右颈内和右颈外动脉, 然后在导丝引导下将1. 5mm 或2. 0mm 直径球囊导管经右颈外动脉至颈总动脉入主动脉弓将气囊充气, 自颈外动脉后退, 机械扩张右侧颈动脉, 重复3次, 每次30
s, 致右颈动脉内膜剥脱及机械损伤, 撤出导管。在穿
刺点近侧结扎右颈外动脉, 室温下标准混合饲料喂养。球囊成形术造模主要特点为:动脉管径及动脉壁组织学显示早期主要是内膜剥脱、弹力环回缩, 弹力板的破坏及血栓形成。7d 后见到新生内膜增生细胞成份, 主要为平滑肌细胞及细胞外大量基质, 富含胶原纤维, 可以看到少数处于分裂状态的平滑肌细胞, 随着时间的延长这些变化更明显, 但球囊成形造模过程复杂, 而且破坏血管内皮细胞的完整性, 其病理基础更类似于外伤的血管改变, 适用于外科术后的
制作方法
[9, 10]
:兔麻醉后, 将2个帽状石墨金电
极种植在右侧颈动脉的外膜, 从颈动脉引出的阴极和阳极导线连接到颅骨上放置的塑料插座。恒定电流
() 内膜增生及纤维帽形成的研究, 另外造模还需要X 线和导管专项技术, 造价也较高
2. 4 空气造模法
[15]
脂喂养下, 也较难发生动脉硬化, 因此该模型更适合支架植入的实验研究。
3 结论与展望
Hol m 等
[21]
。
模型制作方法
[16, 17]
:兔为实验对象, 用干燥气体
研究的数据显示人的斑块脂核区, 其
损伤结合高脂饲料喂养制作双侧颈动脉粥样硬化模型。兔麻醉后, 外科法暴露颈总动脉, 阻断颈总动脉血流, 于近端阻断夹的远侧处刺入静脉输液针, 在远端阻断夹的近侧穿出管腔, 再将针头缩回管腔内; 由穿刺针向隔离的颈动脉段内注入生理盐水, 用医用氮气吹入血管腔。而后以生理盐水置换出管腔内气体, 恢复血流。由于干燥的气流直接接触血管内膜, 内膜将受到损伤, 中膜损伤相对轻微, 与球囊法制作的模型相比, 空气造模并未造成动脉壁的全层损伤。模型可见内弹力板处局部细胞开始增殖、血管平滑肌细胞向内膜下迁移和增殖, 一些增生的中膜层平滑肌细胞开始向内膜下迁移、肌源性的泡沫细胞增生各家报道气体流量不同, 大的差异, , 人为地改变了脑血流动力学。
2. 5 鼠的颈动脉狭窄模型
主要成分为巨噬细胞。兔模型的斑块特征也是巨噬细胞占主导, 与此相反的是球囊诱导的鼠内膜损害模型几乎完全是平滑肌细胞及带有少量炎性单核细胞和T 淋巴细胞组成。但是人的动脉斑块中和动物模型比含有更大比例的巨噬细胞和T 淋巴细胞。在所有病理损害类型中, 细胞中诱导的II 级组织相容抗原提示, 发生了T 淋巴细胞激活的免疫反应。研究观察不同亚群的平滑肌细胞, 可能代表着对免疫中介物已有研究证实了兔的颈, , 也适用于纤维帽形成的研究。随着分子生物学技术的发展, 完全模仿再现人类颈动脉狭窄的模型将会问世。
参
考
文
献
模型制作方法
[18, 19]
:小鼠麻醉后, 颈部做一正中
01 Lastas A , Graziene V , Barkauskas E, et al . Car otid artery ather 2
oscler otic p laque:clinical and mor phol ogical 2i m munohist ochem ical correlati on. Med Sci Monit, 2004, 10(11) :60626014. 02 Hennerici MG . The unstable p laque. Cerebr ovasc D is, 2004, 17
(l3) :17222.
03 De Jahr om i AS, Cina CS, L iu Y, et al . Sensitivity and s pecifici 2
ty of col or dup lex ultras ound measure ment in the esti m ati on of in 2ternal car otid artery stenosis:a syste matic revie w and meta 2analy 2sis . J Vasc Surg, 2005, 41(6) :9622972.
04 Soma, Maurizi o R , Donetti, Elena, et al . Recombinant Apoli 2
pop r otein A 2I sub M ilano D i m er I nhibits Car otid I nti m al Thicken 2ing I nduced by Perivascular Mani pulati on in Rabbits . Circ Res, 1995, 76(3) :4052411.
05 Nanobashvili J , Prager M , Jozkowicz A , et al . Positive effect of
treat m ent with synthetic ster oid hor mone tibol on on inti m al hyper 2p lasia and restenosis after experi m ental endothelial injury of rabbit car otid artery . Eur Surg Res, 2004, 36(2) :74282.
06 Ohtani K, Egashira K, H iasa K, et al . B l ockade of vascular en 2
dothelial gr owth fact or supp resses experi m ental restenosis after in 2tralum inal injury by inhibiting recruit m ent of monocyte lineage cells . Circulati on, 2004, 110(16) :244422452.
07 Meyer, Guido R Y, Van Put, et al . Possible Mechanis m s of Col 2
lar 2I nduced I nti m al Thickening . A rteri oscler Thr omb Vasc B i ol, 1997, 17(10) :192421930.
08 Chekanov VS, Mortada ME, Tchekanov G V , et al .
Pathol ogic
切口, 分离暴露颈总动脉, 在左颈总动脉分支处, 完全结扎阻断血流。通过左颈总动脉血流的阻断, 在2周和4周的恢复过程中, 由于改变的血管剪切力而引起血管再构和血管腔面积的缩小。结扎处的动脉壁张力增加, 刺激血管平滑肌细胞的增生反应, 形成了鼠颈动脉狭窄。从小鼠的颈动脉狭窄病理来看, 炎症细胞参与了早期的血管狭窄, 在外膜、中膜和发展中的新内膜都有白细胞的浸润。研究认为血管再构对慢性管腔面积改变有重要影响, 对晚期血管面积丧失起重要作用, 这种抑制或促进血管再构的机体内在机理是决定血管狭窄的关键因素, 而这种血管再构和T 淋巴细胞无关, 与人的颈动脉狭窄病理过程差异较大。除该方法制作颈动脉狭窄鼠模型外, 尚有免疫缺陷动脉硬化的小鼠, 但尚未见有局限性颈动脉狭窄的免疫缺陷小鼠模型的报道。
2. 6 犬的颈动脉狭窄模型
模型制作方法
[20]
:犬静脉麻醉后, 分别经双侧颈
动脉壁小口送入球囊导管, 充盈球囊, 反复牵拉球囊数次, 损伤血管内皮, 缝合血管壁切口。在损伤远端部位以11～0缝线环形缩窄颈总动脉, 处理好皮肤切口, 1周即形成颈动脉狭窄模型。由于犬类即使在高
and hist ol ogic results of electrical i m pulses in a rabbit model of ather oscler osis:242hour versus 82hour regi m en. 2002, 35(3) :5542562.
09 Betz E, Schl ote W. Res ponses of vessel walls t o chr onically ap 2
p lied electrical sti m uli . Basic Res Cardi ol, 1979, 74(1) :10220.
10 Khurana R , Zhuang Z, Bhardwaj S, et al . Angi ogenesis 2depend 2
ent and independent phases of inti m al hyper p lasia. Circulati on, 2004, 110(16) :243622443.
11 Hegyi L , Hockings P D , Bens on G M , et al . Short Ter m A rterial
Remodelling in the Aortae of Cholester ol Fed Ne w Zealand W hite Rabbits Shown in vivobyH igh 2Res oluti on Magnetic Res onance I m a 2ging 2I m p licati ons for Human Pathol ogy . 2004, 10(3) :1602167.
12 D ietrich G, Tepe T, Grafen F, et al . Reducti on of inti m al hyper 2
p lasia with Re 21882labeled stents in a rabbit model at 7and 26weeks:
an experi m ental study .
Cardi ovasc I ntervent Radi ol,
Pathol Oncol Res,
J Vasc Surg,
15 Booth RF, Martin JF, Honey AC , et al . Rap id devel opment of
ather oscler otic lesi ons in the rabbit car otid artery induced by perivascular man. A ther oscler osis, 1989, 76(223) :2572268. 16 Van Put DJ , Van O sselaer N , De Meyer GR , et al . Role of Pol 2
y mor phonuclear Leukocytes in Collar 2I nduced I nti m al Thickening in the Rabbit Car otid A rtery . A rteri oscler Thr omb Vasc B i ol, 1998, 18(6) :9152921.
17 Chiesa G, R iga monti E, Monteggia E , et al . Evaluati on of a s oft
ather oscler otic lesi on in the rabbit aorta by an invasive I V US meth 2od versus a non 2invasive MR I technol ogy . A ther oscler osis, 2004, 174(1) :25233.
18 Poz o M , Castilla V , Gutierrez C , et al . U rs olic acid inhibits
neointi m a for mati on in the rat car otid artery injury model . A ther o 2scler osis, 2005, 24(3) :5762583.
19 Kumar A , L indner V. Re with neointi m a for mati on in the
mouse of bl ood fl ow. B i ol, S , , DX. I ntravenous and oral antithr ombotic
of the novel p latelet GP II b /III a antagonist r oxifiban (DMP754) and its free acid for m , XV 459. A rteri oscler Thr omb Vasc B i ol, 1999, 19(10) :25235.
21 Hol m J , Hanss on GK . Cellular and i m munol ogic features of car ot 2
id artery disease in man and experi m ental ani m al models . Eur J Vasc Surg, 1990, 4(1) :49255.
A rteri oscler
2005, 28(5) :6322637.
13 Durand E, Mallat Z, Addad F, et al . Ti m e t and cell p r oliferati on and their t o and restenosis after in model . J Am Coll Cardi ol, , (10) :168021685.
14 Gordon AA , Ferns AL , Ste wart L , et al . A rterial res ponse t o
mechanical injure:ball oon catheter deendothelializati on. A ther o 2sclesis, 1992, 3(2) :892104.
内皮抑素、血管内皮生长因子与脑梗死
桂林医学院附属医院神经内科(541001) 刘开祥 蒋静子 综述
中南大学湘雅医院神经内科(410008) 唐北沙 审校
摘 要:内皮抑素(Endostatin ) 能特异性抑制血管内皮细胞的增生、迁移, 并诱导其凋亡, 从而抑制新生血管的形成; 还可抑制斑块内膜血管生成从而抑制动脉粥样硬化斑块的生长。血管内皮生长因子(VEGF ) 可诱导内皮细胞增殖, 促进新生血管形成。内皮抑素和VEGF 作为血管形成的调节因子, 可能与脑梗死的发生、发展及转归密切相关。关键词:血管调节因子; 内皮抑素; 血管内皮生长因子; 脑梗死。
血管的形成受到血管调节因子包括血管生成因子和抑制因子的影响。近年来, Endostatin 和VEGF 分别作为血管生成抑制因子和促血管生成因子在肿瘤的抗新生血管治疗中受到了广泛关注
[1]
tin 和VEGF 作为两种血管调节因子与脑梗死的关系
是值得我们去探讨的, 现对相关研究作一综述。
1 内皮抑素(Endostatin ) 与脑梗死1. 1 Endostatin 的结构
1997年, O ’eilly 和Folkman 在鼠内皮细胞瘤
。脑梗死的
发生、发展及转归与脑血管的病变密切相关, Endosta 2
收稿日期:2005207218; 修回日期:2005212206() 作者简介:刘开祥19652, 男, 副主任医师, 在读硕士。主要从事急性脑血管病治疗的研究。