巾山大学硕士学位论文嗅鞘细胞移植后许脊舶中迁移特忡的研究
嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
专业：外科学
研究生：马元琛
导师：沈慧勇研究员
摘要
背景和目的：
脊髓损伤是严重危害人类健康的疾瘸，随着我国交通事业及现代化工业的发展，近年来脊髓损伤的发病率有上升趋势。传统观点认为，发育成熟的哺乳动物中枢神经损伤后，由于神经元自身再牛能力差和胶质微环境的抑制，损伤神经是不能再生的。嗅鞘细胞是目前所知唯一能够诱导支持周围神经长入中枢神经的胶质细胞，移植入脊髓后不ｆＥｌ能诱导神经再生，还能促进损伤脊髓的功能恢复。１５等于１９９７年在Ｓｃｉｅｎｃｅ上首次报道了应用嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤，此后大量的研究证明，０ＥＣｓ移植修复ＣＮＳ的损伤具有广阔的应用前景。本实验通过将ＯＥＣｓ移植在大鼠横断的脊髓中，观察其在脊髓中的乍存、迁徙行为，了解其在移植后的生物学特性，进一步探讨其促进ＣＮＳ再生的作用机理。
材料与方法：
一、细胞培养
从成年ＳＤ（Ｓｐｍｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ）大鼠嗅球取材进行嗅鞘细胞原代培养，利用差异贴壁方法进行纯化培养，清除绝大部分神经元及其它混合细胞，使细胞成分相对单一
中ｄｌ大学硕士学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
化。低亲和力神经牛长因子受体（Ｌ—ＮＧＦＲ）免疫染色鉴定嗅鞘细胞，移植前使用双苯亚甲胺（ｔｔｏｅｃｈｓｔ３３３４２）标记嗅鞘细胞。
二、动物实验
３６只２月龄ＳＤ雄性大鼠，体重３５０±２０ｇ，随机分为３组，各１２只大鼠：近端组在脊髓横断的近端移植嗅鞘细胞；远端组在脊髓横断的远端移植：对照组不横断脊髓，单纯移植。大鼠于１０％水合氯醛（３００ｍｇ／ｋｇ体重）腹腔麻醉后，背部正中切口，显露第ｌＯ胸椎并行全椎板切除（必要时切除部分胸９及胸１ｌ部分椎板），近端及远端组用显微外科剪将胸１０水平脊髓半横断，建立大鼠胸髓损伤模型。近端组采用显微注射法，于术中注入２ｕｌ嗅鞘细胞悬液（１ＸＩＯ７个／ｍ１）至脊髓横断近端０．５ｍｍ处；远端组动物于术中注人２ｕｌ嗅鞘细胞悬液（１Ｘ１０７个／ｍ１）至脊髓横断远端０．５ｍｍ处；对照组作为对照，不行脊髓横断，单纯将嗅鞘细胞悬液２ｕ１注入胸１０水平脊髓ｒｈ９－０无创伤线缝合硬脊膜，然后依次缝合肌肉及皮肤。术后常规挤压放尿及定时翻身。
二组在移植后１、２、４、６周各随机选出２只，４％ｏ多聚甲醛心脏灌注，切取Ｔ６～Ｌ１的脊髓标本。然后多聚甲醛固定４小时，放入３０％蔗糖溶液至标本沉底。ＯＴＣ包埋，冰冻纵行切片，厚度３０ｐｍ，在荧光显微镜下观察存活的嗅鞘细胞位置，在３５０ｎｍ的紫外光下染色剂发出蓝色荧光。
结果：
在术后１周，近端组可观察到嗅鞘细胞主要集中在注射区，少量细胞开始向头端迁移，同样远端组的嗅鞘细胞也集中在注射区，少量向尾端迁移，对照组的基本集中在注射区。
在术后２周，近端组的嗅鞘细胞开始有大量的沿脊髓长轴的方向向头端迁移，最远约３ｍｍ，远端组的嗅鞘细胞也观察到明显的向尾侧迁移。在以上两组，没有观察到嗅鞘细胞迁移到断端对侧。虽然少量嗅鞘细胞也按与脊髓长轴垂直的方向迁移，但在没有横断侧的脊髓，嗅鞘细胞分布很少。在对照组，嗅鞘细胞的分布比术后１周轻微扩大，但分别区域仍然非常局限，远远比不上横断组的距离。
术后４Ｎ，近端组和远端组的嗅鞘细胞进一步沿着脊髓长轴纵向迁移，在注射的ＩＩ
巾ＩＩ』大学硕十学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究同侧可达到６ｍ，值只有少量的嗅鞘细胞能够越过断端。大量的嗅鞘细胞都局限在脊髓白质中，并没有进入灰质。在对照组，嗅鞘细胞仍然是局部的扩散。
术后６周，结果与术后４周类似。近端组和远端组的嗅鞘细胞迁移更远，最远达８ｍｍ，但能够穿过疤痕，到达断端对侧的细胞数量很少。
结论：
１．从成年大鼠嗅球，采用差异贴壁法纯化成鞘细胞简单易行、费用低廉，增殖迅速
可获得较高纯度嗅鞘细胞：
２．嗅鞘细胞移植入体内可以长时间存活，整合到自质中，在白质中进行迁移：３．嗅鞘细胞迁移丰要沿着与脊髓长轴平行的方向进行：
４．嗅鞘细胞向头端和尾端迁移的速度没有明显区别；
５．只在有损伤的脊髓中进行迁移，在不损伤的脊髓中不迁移。
关键词：嗅鞘细胞；脊髓损伤；迁移：细胞移植儿Ｉ
中Ｌ１１人学硕士学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究ＯｌｆａｃｔｏｒｙＥｎｓｈｅａｔｈｉｎｇＣｅｌｌｓ：ＭｉｇｒａｔｉｏｎＰｒｏｐｅｒｔｙａｆｔｅｒ
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Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：ＭａＹｕａｎ－Ｃｈｅｎ
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１．ＣｅｌＩｃｕｌｔｕｒｅ
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２．Ａｎｉｍａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
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中山大学硕十学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓巾迁移特陀的研究
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Ｆｏｕｒｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｓｕｒｇｅｒｙ，ＯＥＣｓｉｎｃｅｐｈａｌａｄｇｒｏｕｐａｎｄｃａｕｄａｌｇｒｏｕｐｃｏｎｔｉｎｕｔｅｔｏｍｉｇｒａｔｅｄｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌｙ．Ｔｈｅｒａｒｅｓｔｍｉｇｒａｔｉｏｎｒａｎｇｅｗａｓ６ｍｍ．ＷｅｆｏｕｎｄｅｄｆｅｗＯＥＣｓｔｈｅｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎｇａｐａｎｄｒｅａｃｈ
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ｎｏａｎｄｄｉｄｎ’ｔｅｎｔｅｒｔｈｅｇｒａｙｍａｔｔｅｒ．ＴｈｅＯＥＣｓｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓｔｉｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ．
Ｓｉｘｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｓｕｒｇｅｒｙ，ＯＥＣｓｉｎｃｅｐｈａｌａｄａｎｄｃａｕｄａｌｇｒｏｕｐｗｅｎｔｆｕｒｔｈｅｒａｎｄｆｕｒｔｈｅｒ．Ｓｏｍｅｍｉｇｒａｔｅｄｔｏ８ｍｍｆｒｏｍｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎｇａｐ．Ｃｅｌｌｓｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｏｐｐｏｓｉｔｅｓｉｄｅｓｔｉｌｌｒａｒｅ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：
１．Ｔｈｅｃｅｌｌｃｕｌｔｒｕｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｔｉｍｅａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｃａｎｏｂｔａｉｎａｇｒｅａｔｎｕｍｂｅｒｏｆ
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２．Ａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｔｒａｎｐｌａｎｔｅｄｉｎｔｏｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ，ＯＥＣｓ
ｃａｎｃａｎｓｕｒｖｉｖｅｆｏｒａｌｏｎｇｔｉｍｅ．ＯＥＣｓａｌｓｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｉｎｔｏｗｈｉｔｅｍａｔｔｅｒｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄａｎｄｍｉｇｒａｔｅｗｉｔｈｉｎｗｈｉｔｅｍａｔｔｅｒ．
ｔｏ３．ＯＥＣｓｍｉｇｒａｔｅｐａｒａｌｌｅｌｔｈｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｏｆａｘｏｎｓｉｎｗｈｉｔｅｍａｔｔｅｒｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ．ＶＩ
中山大学硕十学位论文嗅鞘细胞移植后存脊髓巾迂移特性的研究
４．Ｔｈｅｒｅｉｓ
ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ．ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｓｐｅｅｄｏｆｒｏｓｔｒａｌｏｒｃａｕｄａ
５．ＯＥＣｓｏｎｌｙｍｉｇｒａｔｅｉｎｉｎｊｕｒｅｄｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ，ｉｔｄｏｅｓｎ’ｔｍｉｇｒａｔｅｉｎｉｎｔａｃｔｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｏｌｆａｃｔｏｒｙｅｎｓｈｅａｔｉｎｇｃｅｌｌｓ，Ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｅ，Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ＣｅｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
中山大学硕士学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
研究背景
脊髓神经损伤的研究进展
脊髓损伤（Ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ）是严重危害人类健康的疾病，随着我国现代化工业及交通事业的发展，近年来脊髓损伤的发病率有上升趋势。根据北京市２００２年的统计，我国脊髓损伤的致病原因主要有高处坠落、交通事故、重物砸伤、体育活动等，每年的发病率大约为６０／ｌｏｏ万。１。脊髓损伤多发生在青壮年男性，男女比例为３．１１：１，平均年龄４１．７岁。脊髓损伤为ｆ“重致残性疾病，约一半的患者发生四肢瘫痪”１。一旦发生截瘫，就严重影响患者生活自理能力和劳动能力，同时治疗时间长，花费巨大，功能常常是恢复很慢甚至不恢复。这不但导致了截瘫病人的痛苦，同时给家庭及社会带来了的沉重负担。虽然脊髓损伤患者的寿命已于正常人寿命接近，但截瘫患者仍是生活在无法实现的康复希望中。因此脊髓损伤目前已成为全球科学工作者关注的重大课题之一。
脊髓损伤的研究一直是神经科学界探讨的热点，而脊髓损伤后的神经修复和功能重建也一直困扰着临床医学界。既往认为在哺乳动物，发育成熟的中枢神经细胞的轴突损伤后在自然条件下几乎不能再生，其原因是中枢神经微环境不利于轴突再生，中枢神经细胞本身的再生能力低下，以及神经轴突不能穿越损伤瘢痕区到达靶细胞。脊笳是中枢神经系统的重要组成部分，轴突损伤后也不能再生。脊髓损伤后不但造成灰质的坏死，还有白质中上行及下行神经束的中断，从而导致运动、感觉及植物神经功能的丧失。脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤，二者均可引起部分神经元的丢失和神经纤维的断裂；而继发性损伤可导致原发性损伤范围的扩大，使更多的神经元凋亡和神经纤维的变性、脱髓鞘改变等，从而导致相应部位的感觉、运动和神经反射功能的丧失。但直到２０世纪８０年代，对脊髓损伤的治疗仍然是前景悲观。直至１９８１年Ａｇｕａｙｏ等研究发现损伤后的中枢神经轴突在合适的环境下可以再生。’，才对脊髓损伤后恢复提出了突破性观点。近年来，随着医学科学的迅速发展，人们对神经元轴突再生调控因素有了进一步的了解，特别是对神经轴突生长、导向、定位靶向和突触稳定性的细胞和分子机制
中山犬学项十学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究的日益深入了解，以及有关抗体和生长因子的应用，对脊髓再生研究的概念和方法都产生了重要的影响和积极的推动作用。
现在脊髓损伤的血步疗法在国际上已被临床医生所接受，也已开始在国内应用１－…。其主要内容为：（１）早期给予大剂量甲基强的松龙。（２）外科干预，保护神经。（３）积极地实施移植和再生措施，包括各种组织和细胞的移植。（４）克服再生屏障。（５）尽早开始康复训练。
在所有的治疗方法中，细胞移植被证明是对恢复功能的有效方法，同时也是非常有前途的方法之一”１“。选择的移植材料是否理想，直接关系到神经再生及其功能恢复。在既往的试验研究中，被证明对动物神经功能有部分的恢复作用的细胞种类有：
（１）中枢神经源性神经元
将胚胎脑中提前去甲肾上腺素能神经元和５一羟色胺能神经元移植到大鼠的脊髓中，不但可以存活还能与宿主组织形成新的神经支配关系。但是由于移植物来源的限制，这一研究成果在临床应用存在一定的困难。
（２）周围神经源性神经元
将分离的背根神经节神经元注射到大鼠损伤的脊髓中，背根神经节神经元不但可以填充这个缺损区域，存活率也很高，软脊膜瘢痕形成更少。
（３）干细胞
干细胞具有自我更新并多向分化为神经元和神经胶质细胞的特点，目前用于脊髓损伤修复研究的干细胞主要有神经干细胞、胚胎干细胞和骨髓基质干细胞。但干细胞研究也有许多困难，比如干细胞的定向分化、迁移、增殖等的认识和精确调控等。
（４）雪旺细胞。
雪旺细胞过去一直认为它的功能仅仅是形成周围神经髓鞘，在神经冲动传导及周围神经再生中发挥作用。但近年来发现雪旺氏细胞还有其它一些重要功能：分泌多种神经营养因子；产生细胞外基质成分和细胞粘附分子；导致轴突生长、延长。
（５）活化的巨噬细胞。活化的巨噬细胞在外周神经系统中能够促成外周神经系统神经元的成功再
中山大学删！ｉ：学位论义蝗鞘利胞移植后在脊髓中迁移特性的研究生是因为它能降解局部废物碎片并分泌一些轴突再生所需的细胞因子。将活化的巨噬细胞移植入中枢神经系统可以诱发轴突的再生。目前，这‘治疗手段在以色列已进入Ｉ期临床试验阶段。
（６）嗅鞘细胞
嗅神经系统是中午区神经系统中唯一有再生能力的结构。嗅鞘细胞作为嗅神经系统独有的结构，特殊的性质使被认为是嗅神经不断再生的条件和基础。它最大优点在于它可以通过周围一中枢神经移形区并存在于中枢环境，而且可以从鼻粘膜获得，取材方便。体外培养高纯度嗅鞘细胞亦获得成功，从而使得嗅鞘细胞在临床应用于脊髓损伤成为可能。自１９９７年以来，众多学者都证明了嗅鞘细胞能促进脊髓损伤大鼠的功能恢复。因此，目前嗅鞘细胞移植被认为是最有ｌ临床应用前景的方法之一。
嗅鞘细胞的研究进展“”
嗅神经元终生具有再生能力，一般情况下，平均每４～８周，嗅神经就更新换代一次。在此过程中嗅神经元要正确的分类成束而且要穿过筛板、迁移入嗅球并与嗅球颗粒层中的二级神经元一一僧帽状细胞的树突形成突触。研究嗅神经系统的组织结构发现除嗅神经细胞和星形胶质细胞以外，其中还有一种体积较大的胶质细胞，它包绕在嗅神经的周围，这种细胞被命名为嗅鞘细胞。嗅鞘细胞细胞是一种大神经胶质细胞，广泛存在于嗅粘膜、嗅神经和嗅球的最外两层（嗅神经纤维层和嗅小球层）。许多证据表明。嗅鞘细胞直接起源于鼻板，有别于起源于脑泡存在于的中枢神经系统的胶质细胞包括星形胶质细胞和少突胶质细胞。早在１９８１年，Ｄａｖｉｄ等“”就发现了嗅鞘细胞具有使神经轴突生长延长的特性，但没有引起人们的足够重视：直到１９９３年Ｂａｒｎｅｔｔ等“”再次报道了从大鼠的嗅球中分离、纯化出嗅鞘细胞，在体外培养中，对比研究了嗅鞘细胞与星形胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺氏细胞的差别，得出了嗅鞘细胞是一种不同于其他神经胶质细胞的新型胶质细胞的结论。
嗅鞘细胞的存在使嗅系统成为中枢神经唯一可以再生的结构”“”１，当中枢的嗅神经轴突再生时，嗅鞘细胞可包裹其生长，并阻止其与ＣＮＳ其它胶质细胞接触。嗅鞘细胞在其膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子，如调控嗅神经
中山大学硕｛：学位论艾嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究轴突延长的Ｌ１样细胞粘附分子基因（ＬＩ）、神经细胞粘附分子（Ｎ－ＣＡＭ）、层粘连蛋白（Ｌａｍｉｎｉｎ）、纤维连接蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、促进神经生长因素的分子源自于胶质细胞的Ｎｅｘｉｎ和Ｓ１００。嗅鞘细胞能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子，如虹小板源生长因子、神经肽Ｙ、Ｓ［００、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子一３和神经营养因子一４等。移植早期嗅鞘细胞能够显示快速且多样的形变能力，包括形变为小圆形、大扁平形、纺锤状的雪旺氏细胞形以及多极细胞，而同种环境下的其它神经细胞的形态相当稳定。提示嗅鞘细胞能够改变自身形态以适应复杂的微环境。毫无疑问，嗅鞘细胞的这些特性为神经再生建立了良好的环境。
研究嗅鞘细胞促进神经生长的特性最早是在啮齿类动物的模型上进行。
１９９４年，Ｒａｍｏｎ—Ｃｕｅｔｏ和Ｎｉｅｔｏ—Ｓａｍｐｅｄｒｏ首先报道了将嗅鞘细胞局部移植，成功地促进了横断的背根神经节轴突再生１１６。１９９７年Ｌｉ等在Ｓｃｉｅｎｃｅ上第１次报道了应用嗅鞘细胞移植来治疗脊髓损伤１１。。他们把成年大鼠的－Ｎ颈部皮质脊髓束切断，造成急性脊髓损伤模型，然后将培养的嗅鞘细胞悬液注入到损伤部位。３～１０周，陆续发现切断的皮质脊髓束延伸生长，穿过损伤区，最后到达下位脊髓的前角神经元处，形成功能性连接。沈慧勇等在国内率先进行了嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤的系列研究，证实当嗅鞘细胞被移植入成年鼠的脊髓损伤区内，它们能与宿主神经实体组织结合为一体，诱导再生轴突穿过抑制屏障长入远端。此后大量的研究也证明，嗅鞘细胞移植修复中枢神经系统的损伤具有广阔的应用前景。
虽然国内外学者对嗅鞘细胞在嗅神经系统内的生理特性、功能已有详尽的研究，但对移植后的嗅鞘细胞的生理特性还了解不多，对于嗅鞘细胞的作用原理还不甚明了。对于嗅鞘细胞能否在脊髓中长距离迁移还有争议，Ｓｍａｌｅ认为嗅鞘细胞没有明确的迁移”…，但Ｌｐ”和Ｇｕｄｉｎｏ—Ｃａｂｒｅｒａ””认为嗅鞘细胞有迁移能力。本实验通过将嗅鞘细胞移植到大鼠横断的脊髓中，观察其在损伤脊髓中的生存、迁徙行为，了解其在移植后的生物学特性，进～步探讨其促进ＣＮＳ再生的作用机珲。
中山人学硕｛：学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
成年大鼠嗅鞘细胞培养和染色
材料和方法
一、材料与仪器
Ｌ一多聚赖氨酸（ＭＷ：１５万．３０万）
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色剂
Ｌ．ＮＧＦＲ抗体
ｓＰ超敏试剂盒
胎牛血清（特级）
ＤＦｌ２培养粉
多聚甲醛（分析纯）
ＮａＨＣ０３（分析纯）
胰蛋白酶
５％新洁尔灭溶液
ＤＡＢ显色试剂盒
２５ｃｍ２的斜口塑料培养瓶
２４孔培养板
超净工作台
显微手术器械
Ｈｅｒａｕｓ细胞培养箱
Ｃ０２培养箱
倒置显微镜
荧光显微镜
二、方法
１．试验前的准备Ｓｉｇｍａ公司Ｓｉｇｍａ公司武汉博士德公司福建迈新公司Ｇｉｂｅｏ公司Ｇｉｂｃｏ公司北京化学试剂公司北京化学试剂公司Ｇｉｂｃｏ公司江话德成制药有限公司博士德公司丹麦ＮＵＮｃ公司丹麦ＮＵＮＣ公司苏州净化设备仪器厂苏州医疗器械总厂德国Ｈｅｒａｕｓ公司ＳＡＮＹＯ公司０１ｙｍｐｕｓ公司Ｏｌｙｍｐｕｓ公司
中山大学硕Ｌ学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究１．１溶液的配制
（１）０．１ｍｇ／ｍｌ多聚赖氨酸溶液的配制
取多聚赖氨酸１０ｍｇ，溶于１００ｍｌ四蒸水中，运用孔径０．２２ｌａｒｎ的一次性滤器过滤除菌，分装到１ｍｌ／支的小离心管内，＿２０。Ｃ储存备用。
（２）青霉素储存液（１×１０５／ｍ１）的配制
８０万单位青霉素，溶于８ｍｌ四蒸水中，运用孔径为０．２２岫的一次性滤器过滤除菌，分装，一２０℃储存。
（３）链霉素储存液（１×１０５／ｍ１）的配制
１００万单位链霉素，溶于１０ｍｌ四蒸水中，运用孔径为Ｏ．２２９ｍ的一次性滤器过滤除菌，分装，＿２０。Ｃ储存。
（４）Ｄ液即Ｄ，ＨａｎＫｓ液的配制
ＮａＣＩ，８９；ＫＣｌ，０．４９；ＮａｚＨＰ０４‘Ｈ２０，Ｏ．０６９；ＫＨｚＰ０４，Ｏ．０６９；ＮａＨＣ０３，０．３５９，酚红０．０２９，溶于１０００ｍｌ四蒸水中，调节ｐＨ至７．３５，过滤，分装，４。Ｃ储存。
（５）ＤＭＥＭＪＦｌ２培养液的配制
ＤＭＥＭ／Ｆ１２干粉一包，再加葡萄糖５．７克，ＮａＨＣ０３１．２克，溶于１０００ｍｌ四蒸水中，ＮａＯＨ／ＨＣＬ调节ｐＨ值至７．２过滤，分装，４℃储存。最终含糖６９／Ｌ。加青霉素和链霉素，青霉素终浓度为１０００Ｕ／ｍｌ，链霉素终浓度为１０００Ｕ／ｍｌ。
（６）０．１ＭＰＢＳ的配制：
Ｎａ２ＨＰ０４‘１２Ｈ２０，２．９：ＮａＣＩ，８９；ＫＨ２Ｐ０４，Ｏ．２９．加四蒸水至１００ｍｌ溶解，用１Ｎ的盐酸或１Ｎ的ＮａＯＨ调节ｐＨ至７．３～７．４，配成０．１Ｍ的ＰＢＳ保存，用时稀释１０倍即成Ｏ．０１Ｍ的ＰＢＳ。
（７）ＨＢＳ￥溶液：
ＨＢＳＳ粉９．８９，加入１０００ｍｌ四蒸水中，０．２２
口保存。
１．２试验物品的准备
（１）塑料培养瓶的准备：
取Ｏ．Ｉｍｇ／ｍｌ多聚赖氨酸溶液１支加入Ｄ液３ｍｌ，混匀，加入培养瓶内，加入液体量以能覆盖瓶底为宜（约２ｍ１）。置于３７。Ｃ培养箱中，作用２—４小时后，１．１ｍ微孔滤膜过滤除菌，４。Ｃ封
中山人学顾十学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究吸出多聚赖氨酸溶液回收再利用（可反复使用３次），用四蒸水洗培养瓶３—５次，吸干培养瓶内液体，拧紧瓶盖，置于４。Ｃ冰箱内备用。
（２）无菌间、超净台的准备：
培养前无菌问、超净台需要紫外线消毒２小时，同时需要消毒的包括：显微镜、无菌衣、口罩、帽子、培养皿。
（３）器械的准备：
器械包括剥离剪、止血钳、虹膜剪以及显微器械，器械在使用前需用７５％酒精浸泡１小时。
２．标本的选择和获得
２．１．试验对象２．５个月的Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ大鼠
２．２．培养
（１）处死动物及消毒
选取２．５个月的ｓＤ大鼠（２００～２５０９），断头法处死，将鼠头置入盛有３％碘酒的小烧杯中，浸泡５分钟；倒去碘酒，加入７５％酒精，脱碘１０分钟。
（２）取材
取材过程在超净台内完成，自鼠头颈后皮肤纵向、向上用剥离剪剪至鼠鼻部，向两侧分离，充分暴露颅骨，沿颅骨后正中剪开，用止血钳去除颅骨，暴露大脑实质，在颅前窝，颅骨与大脑实质之间分离，将大脑实质向后翻起，剪断视神经，暴露出双侧嗅球，分离嗅球与颅骨间的连接，取下嗅球。
将取下的嗅球迅速置于盛有Ｄ液的无菌小培养皿内，培养皿放在冰袋上。这时根据试验准备情况决定下一步的操作，如果各方面条件还未成熟，可先将盛有嗅球的培养皿密封好放入４。Ｃ的冰箱内保存，尽快完善试验条件后再进行后续的操作；如果试验条件已经准备充分，就可进行下一步的操作，继续取材。
在解剖显微镜下（放大２０倍），首先去除软脑膜及可见的毛细血管网，接着顺嗅球长轴方向夹碎嗅球，可见嗅球颗粒主要有白质和红质（淡红）两部分组成，去除白质部分，保留富含嗅鞘细胞的嗅神经层及嗅球颗粒层（淡红色）。上述取材过程，标本均在Ｄ液内放置，培养皿置于冰袋上降温。将取出的组织置于培养皿盖上，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，将破碎的组织加入０．２５％胰蛋白
中山大学硕Ｌ学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究酶中，于３７。Ｃ培养箱中消化。此操作过程平均需要３０分钟。
（３）培养
消化２０分钟后，吸出组织加入盛有含２０％胎牛血清（ＦＣＳ）的ＤＦ，：培养基的离心管中作用１０分钟，中止胰酶的消化反应。然后将漂浮在培养液中絮状组织小心吸出，在另－－Ｎ有２０％ＦＣＳ的ＤＦ．：的离心管内漂洗三遍，最后用２０％ＦＣＳ的ＤＦ。：培养基将其制成单细胞悬液，以１×１０５／ｍＪ＿的密度接种于未涂胶的底面积为２５ｃｍ２的斜口塑料培养瓶中，于３７。Ｃ、５％二氧化碳培养箱中进行培养。
（４）嗅鞘细胞的纯化
成年大鼠的嗅鞘细胞置５％Ｃ０。孵育箱于３７。Ｃ分别培养１２小时，将培养上清连同未贴壁细胞转种于另…个未涂胶的玻璃培养瓶，再分别培养１８～２４ｈｒｓ：驭上清调整细胞密度为ｌ
进行培养。Ｘ１０６，种植于经Ｐｏｌｙ—Ｌ—Ｌｙｓｉｎｅ处理的２４孔板，继续
３．嗅鞘细胞传代
每３—４天换液一次，长满后传代，传代前用ＨＢＳＳ洗３遍，加入０．０５％胰酶ＥＤＴＡ消化，当细胞收缩、脱落时加Ｄ／Ｆ一１２Ｓ培养液停止消化，吹打成单细胞悬液，一般以１：２分瓶。传代使用Ｄ／Ｆ一１２Ｓ培养液。
４．观察
ＯＬＹＭＰＵＳ倒置相差显微镜下进行观察嗅鞘细胞在不同培养时问的生长状态，观察其形态、结构变化和其中的混杂细胞（主要为成纤维细胞）的数量和生长状态。
５．嗅鞘细胞免疫学鉴定（Ｓ－Ｐ法）
经纯化培养的细胞行Ｌ－ＮＧＦＲ免疫组化染色。１。２…。
（１）纯化培养１０天左右的嗅鞘细胞培养皿中的培养液吸去，用ＰＨ值７．４的ＰＢＳ液洗两遍：
（２）培养皿中立即加入ｌｏ％ｑｊ醛液，用于固定细胞，室温下放置３０分钟：（３）吸去甲醛液，用ＰＢＳ振荡洗涤三次，每次５分钟：
中山大学硕．１二学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究（４）在盖玻片细胞面滴加１０％正常非免疫动物血清封闭非特异性抗原３０—６０分钟：
（５）封闭完成后将诈常非免疫动物血清吸出，不清洗，加入Ｌ－ＮＧＦＲ的第一抗体，Ｌ－ＮＧＦＲ的第一抗体滴度为ｌ：５０，在３７。Ｃ温箱中孵育２小时或４℃过夜：（６）再用ＰＢＳ振荡洗涤三次，每次５分钟：
（７）吸干后加入生物素标记的第二抗体，３７。Ｃ下孵育３０－６０分钟；
（８）再用ＰＢＳ振荡洗涤三次，每次５分钟：
（９）加入链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液（试剂Ｄ），室温下孵育１０分钟：（１０）ＰＢＳ冲洗三次，每次３—５分钟：
（１１）加入新鲜配制的ＤＡＢ溶液，显微镜下观察到染色合适为止，约５—１０分钟：（１２）吸干后明胶封片：
（１３）置于倒置显微镜下观察、摄像。以Ｌ－ＮＧＦＲ染色为标准，计算染色阳性及阴性的细胞数，计算纯度。
６．嗅鞘细胞的标记””
（１）把恒温水槽温度精确控制在摄氏３７。，用温度计确定温度无误。将
ＤＭＥＭ放入水槽中预热。
（２）把嗅鞘细胞悬液加入ＤＭＥＭ中，搅拌均匀。
（３）将染色剂双苯亚甲胺（１ｌｏｅｃｈｓｔ３３３４２）慢慢加入，至最终浓度为５
ｇｇ／ｍｌ。
（４）将细胞搅拌均匀后，放在３７。Ｃ的水槽中９０分钟，确保试管完全泡在水中和温度～直控制在３７。Ｃ，在这过程中可以把细胞搅拌几次。
中山人学硕Ｊ‘学位论文嗅鞘细胞移植后ｎ：脊髓中迁移特忡的研究
结果
１．嗅鞘细胞的形态学观察
ＯＬＹＭＰＵＳ倒置相位差显微镜下观察，嗅鞘细胞传代培养１２小时内大部分已经贴壁，呈球形；培养２天后，丌始出现少量双极细胞及三角形细胞，突起短小。大部分细胞体折光性较强，呈三角形、梭形、细胞发出纤细的突起，偶见成纤维细胞出现。双极细胞与三极细胞连成网络状，有些细胞出圆形变成梭形，突起更长细更长。细胞传代贴壁以后呈圆形，逐渐长出突起，但细胞形态较单一，为胞体呈梭形的双极细胞和三极细胞。传代后开始卜２天细胞数目无明显增加，甚至减少，随后细胞数目逐渐增多（图ｌ，２）。
２．免疫组化染色
Ｌ－ＮＧＦＲ染色阳性的细胞呈多极和梭形，计算纯度在９３．５％。（图３）。
３．荧光观察
经双苯亚甲胺（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）染色的嗅鞘细胞在３５０ｎｍ的紫外光下发出蓝色荧光（图１０）。
中山大学硕ｆｊ学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究
大鼠急性脊髓损伤模型的制作及嗅鞘细胞移植
材料和方法
１．实验动物
本实验选用广东省医用动物实验中心提供的清洁级封闭群雄性
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠，采用颗粒型普通大鼠饲料（含蛋白２３％，脂肪４．７％，钠盐Ｏ．２４％）喂养，饮用自来水，动物温度控制在２０摄氏度左右，光照周期为１２小时以模拟正常昼夜生理节奏。
２．实验场所
所有模型制备均在中山大学实验动物中心二级实验室完成，手术场所及
所用器械经严格消毒，全部在无菌条件下进行。
３．模型制备方法
选用鼠龄６０～７０天，体重３３０～３６０克的雄性Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ大鼠３６只。术前１２小时禁食。
３．１麻醉方法
采用浓度为１０％的水合氯醛，剂量为３ｍｌ／Ｋｇ体重。埘大鼠进行腹膜注
射，１０～１５分钟后动物进入麻醉状态。
３．２动物分组
３６只ＳＤ大鼠随机分为三组：在脊髓横断近端移植嗅鞘细胞的近端组（１２
只大鼠）；在脊髓横断远端移植嗅鞘细胞的远端组（１２只大鼠）：不横断脊髓，单纯做嗅鞘细胞脊髓移植的对照组（１２只大鼠）。
中山大学颁十学位论文嗅鞘细胞移植后在脊髓中迁移特性的研究３．３手术方法
麻醉的ＳＤ大鼠俯卧置于操作台上，用绳子固定四肢及头部（图５）。常规碘酒、酒精消毒，作背部正中切口，长约３厘米，从胸８～胸１２棘突。顺次切开皮肤、皮下，贴椎板切开竖棘肌并向两边剥离至横突外侧，显露第８～１２胸椎的椎板。用小咬骨钳作胸１０的全椎板切除，显露硬膜。近端组和远端组的１６只ｓＤ大鼠作脊髓半横断：避丌脊髓后动脉，用显微外科剪在约胸１０的水平将脊髓半横断（图６），此时大鼠伤侧的后肢发生抽动，尾巴发生甩动，随后完全松驰。３．４细胞移植
（１）近端组
细心止血后，用微量注射器抽取２¨ｌ用双苯亚甲胺（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）标记的嗅鞘细胞悬液（ＩＸｌ０７个／ｍ１），注射到脊髓近侧距断端０．５ｍｍ处（图７）。为了避免悬液渗漏，让针头在脊髓内停留２分钟，然后抽出注射器。用９－０无创伤线缝合硬脊膜，然后依次缝合肌肉及皮肤。
（２）远端组
用微量注射器抽取２¨ｌ用双苯亚甲胺（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）标记的嗅鞘细胞悬液（１Ｘ１０７个／ｍ１），注射到脊髓远侧距断端０．５ｍｍ处，停留２分钟后抽出注射器。用９－０无创伤线缝合硬脊膜，然后依次缝合肌肉及皮肤。
（３）对照组
取没有作脊髓横断的ｓＤ大鼠８只，用微量注射器将２Ⅲ双苯亚甲胺（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）标记的嗅鞘细胞悬液（１Ｘ１０７个／ｍ１）注射到大鼠胸１０水平就脊髓中，停留２分钟后抽出。逐层关闭切口。
４．术后处理
把大鼠放在温暖的环境待其复苏。麻醉苏醒后分笼饲养，随意饮食，不使用抗生素。每天早中晚各一次观察大鼠肢体活动以及呼吸、饮食等一般状态。对有尿潴留的大鼠每天三次进行挤压放尿，对瘫痪的肢体要防止褥疮形成，每天人工１２
中山人学顶土学位论文嗅鞘细胞移植后扫：脊髓中迁移特性的研究进行翻身。
５．术后运动功能测定
术后第一天对所有的近端组和远端组动物进行运动功能测定，方法采用改良Ｔａｒｌｏｖ平分法。
改良Ｔａｒｌｏｖ评分标准：
０分：完全瘫痪，针刺时下肢无反应：
１分：完全瘫痪，针刺时下肢有反应，但肢体不能活动：
２分：肢体可活动，但不能站立或站立不稳（＜５秒）：
３分：可站立，但无法行走：
４分：可行走数步，但不稳定：
５分：能缓慢行走，但不灵活，存在一定缺陷：
６分：Ｊ下常行走。
６．标本取材及观察
在行嗅鞘细胞细胞移植后第ｌ、２、４、６周，在三组中各随机抽取２只大鼠处死。用３％戊巴比妥钠（３０ｍｇ／Ｋｇ）作腹腔麻醉，丌胸，经左心室向主动脉插管，剪开右心房。快速灌注生理盐水１分钟，随后用４％的多聚甲醛一Ｏ．ＩＭＰＢＳ（ＰＨ７１３－７．５）固定液灌注４分钟，直至右心房流出清澈的无血性液体。
将大鼠置俯卧位，切开皮肤和肌肉，剪断肋骨，将胸６～腰１脊柱整段取出（图８），于４％多聚甲醛溶液中浸泡４～５小时。将外层的肌肉和骨组织除去，取出整段脊髓（图９），移至３０％蔗糖溶液中，４。Ｃ冰箱过夜待标本沉底。用０ＴＣ包埋标本，作冰冻纵行切片，厚度３０Ｈｍ。最后用丙酮固定切片ｌＯ分钟。
在荧光显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１）下观察存活的嗅鞘细胞位置，在３５０ｎｍ的紫外光下染色剂Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２发出蓝色荧光（图１０）。