第41卷第4期2007年12月华中师范大学学报(自然科学版)
JOURNALOFHUAZHONGNORMALUNIVERSITY(Nat.Sci.)Vol.41No.4
Dec.2007
文章编号:100021190(2007)0420553204
硅胶柱层析法提纯茶多酚的研究
袁 华13,吴 莉1,吴元欣1,池汝安1,凌 敏2,喻宗沅2
(1.武汉工程大学化工与制药学院,武汉430073;2.湖北省化学研究院,武汉430074)
摘要:采用硅胶柱层析法分离精制茶多酚.以粗茶多酚为原料,脱剂,得到的茶多酚儿茶素总含量可达到90%以上,,最高接近60%,咖啡因含量可降低至不能检出.,关键词:茶多酚;咖啡因;柱层析;中图分类号:;:A
剂和医药保健品.研究表明,茶多酚具有抗癌、抗辐射、抗衰老、降血脂、降血糖等多种功效,这些功效主要归结于茶多酚的抗氧化和清除自由基的能力[1].茶多酚是由儿茶素为主要成分的多酚类混合物,儿茶素可看成是黄酮类化合物的衍生物,包括(+)2儿茶素(C)、(-)2表儿茶素(EC)、(-)2表没
(-)2表儿茶素没食子酸酯食子儿茶素(EGC)、
(ECG)、(-)2表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、(-)2没食子儿茶素没食子酸酯(GCG),这些成分(分子结构式见图1)的生物活性是不同的,其中酯型儿茶素、特别是EGCG的生物活性最高.从茶叶中提取茶多酚的工艺过程中往往使咖啡因(Caffeine)富集,茶多酚中咖啡因含量远高于茶叶中的咖啡因含量.咖啡因是茶多酚生物活性研究
中的干扰成分,过量的咖啡因不仅影响人体正常的生理功能,而且可能伴随其它副作用[2].作为功能性食品添加剂或药用保健原料,既要求茶多酚中含有较高的酯型儿茶素,又要求咖啡因含量尽量降低.
目前从茶多酚中脱除咖啡因的方法有卤代烷烃萃取法、混合溶剂萃取法、树脂吸附法、纤维素吸附分离法等,其中溶剂萃取法往往难以解决氯代烷烃的微量残留问题,而树脂及纤维素吸附分离法或容易造成EGCG等有效成分的损失,或因吸附材料价格而增加提取成本[327].本文通过比较不同的吸附剂的吸附性能,采用硅胶为吸附剂,乙酸乙酯为洗脱剂,对粗茶多酚产品进行硅胶柱层析法分离精制,不仅使茶多酚中的酯型儿茶素得到富集提高,而且能够有效分离茶多酚中的咖啡因
.
图1 儿茶素及咖啡因的分子结构
Fig.1 Chemicalstructureofteapolyphenoland
caffeine
收稿日期:2007205221.
基金项目:湖北省自然科学基金创新群体计划项目(2006ABC014).3E2mail:yuanhua1994@163.com.
554华中师范大学学报(自然科学版) 第41卷
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1原料与试剂 茶多酚由湖北五峰天健植物
表1 不同填料对茶多酚的静态吸附效果
Tab.1 Theadsorptioneffectsofdifferentsorbent
onteapolyphenols
填料种类
C0/(mg・mL-1)C1/(mg・mL-1)
硅胶
1.5000.12092.00
氧化铝
1.5000.83744.20
纤维素
1.5000.57961.40
聚酰胺
1.5000.20586.33
制品有限公司提供;儿茶素单体及咖啡因(生化试剂,Sigma);硅胶GF254(青岛海洋化工厂,60～100目);乙酸乙酯等试剂均为分析纯.1.1.2主要仪器 层析柱(玻璃质1.9cm×50cm);RE252AA型旋转蒸发器;VarianProstar2230型液
吸附率/%
2.2洗脱剂的选择
相色谱仪;NICOLET2IMPACT420型红外光谱仪.
1.2方法
1.2.1度为150mg/.1.2.2蒸馏水洗至中性,过滤,置于干燥箱中于110℃干燥8h备用.1.2.3静态吸附 取经过预处理并干燥至恒重的
,本
.乙酸乙酯、正丁醇、95%,结果表明:环己烷、二氯甲烷极性偏小,不能展开;正丁醇、95%乙醇极性偏大,所有组分都带至前沿;乙酸乙酯能够将茶多酚展开为比较明显的两部分.2.3聚酰胺的动态吸附洗脱
层析用聚酰胺[8]的主要成分为尼龙266,既可分离亲水性物质,又可分离亲脂性物质.取45g聚酰胺,按方法1.2.4动态洗脱得其分离茶多酚的效果如表2.
表2 聚酰胺的动态吸附洗脱效果
Tab.2 Theelutioneffectsofpolyamideindynamicstate组分
Caf
EGC6.1188.915
C2.2271.024
EC
EGCGGCG
ECGTotal/%
硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺各15g,加入浓度为
1.5mg/mL的茶多酚溶液50mL,搅拌均匀后室温静置过夜,分析溶液浓度.1.2.4动态吸附洗脱 取硅胶45g,用适量洗脱剂调匀后湿法装入层析柱中,再取10mL浓度为150mg/mL的茶多酚溶液上柱,乙酸乙酯洗脱,流速1.0mL/min,TLC监测,HPLC分析儿茶素及咖啡因含量.
1.2.5茶多酚总量的测定 按照GB8312-87用酒石酸亚铁法进行比色分析.1.2.6咖啡因含量的测定 按照GB8312-87用紫外分光光度法进行分析.
1.2.7HPLC分析(参照湖南金农生物资源股份有限公司出口检测条件) 色谱柱C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相(体积比)DMF∶CH3OH∶CH3COOH=20∶1∶0.5;流速1.0mL/min;柱温35℃;紫外检测波长:280nm.
原料1.209级份10.348
7.85645.8043.19412.94879.3469.84810.6921.33111.31143.100
1.05210.57645.6770.68810.62064.2040.84411.39649.068
级份20.29211.3172.84110.2149.385级份30.11717.3562.12421.6846.734级份40.15814.3291.63716.5874.119
2结果与讨论
2.1柱填料的选择
4种柱填料的静态吸附实验结果如表1.其中,吸附率=(吸附前的浓度C0-吸附后的浓度C1)/
吸附前的浓度C0×100%.
从静态吸附实验结果可以看出,硅胶的吸附性能最好,聚酰胺次之,纤维素吸附效果一般,氧化铝最差.原因可能是由于硅胶表面具有多孔性的硅氧环交键结构,能够通过氢键与茶多酚中的酚羟基结合,故吸附效果较好.
从表2可以看出,聚酰胺吸附分离茶多酚具有以下3个特点:
①和原料相比,采用聚酰胺吸附分离工艺可以降低茶多酚中咖啡因的含量,能够满足出口茶多酚产品对咖啡因含量
②洗脱液各级份中儿茶素总量下降.③洗脱液中非酯型儿茶素含量增加,酯型儿茶素含量降低,表明聚酰胺会更多吸附酯型儿茶素.可能是由于聚酰胺对酚性物质有较高的吸附力,酰胺中的羰基与酚羟基之间能够形成较强的氢键的缘故.酚性化合物的附着强度在一定程度上取决于所形成氢键的数量和类型.EGCG上的羟基数量最多,所以吸附最明显.
因此该条件下聚酰胺用于茶多酚的分离精制存在缺陷.
2.4硅胶的动态吸附洗脱
取45g硅胶湿法装柱,用浓度为150mg/
mL
第4期袁 华等:硅胶柱层析法提纯茶多酚的研究 555
的茶多酚溶液10mL上柱,乙酸乙酯洗脱,流速1.0mL/min.可观察到柱内颜色明显分为两部分,上段为较深的棕红色,下段为较浅的淡黄色,按照薄层试验TLC监测结果,依次分3级收集洗脱液.将洗脱液旋蒸干燥后,进行HPLC分析,结果如表3.
表3 硅胶的动态吸附洗脱效果
Tab.3 Theelutioneffectofsilicagelindynamicstate
组分
原料级份1级份2级份3保留时间/m
Caf1.2090.0470.0000.000
EGC6.1182.4906.0012.697
C2.2271.2551.6021.037
EC7.8564.3706.4574.518
EGCG45.80430.05560.96423.796
GCG3.1943.2192.1781.574
ECG12.9489.10214.5232.175
Total/%79.34650.53291.72535.792
2.5硅胶的再生
使用后的硅胶依次用适量乙醇、蒸馏水洗涤,过滤后于110℃干燥8h得到再生的硅胶.按2.4方法进行柱层析,分离结果如表4.
表4 再生硅胶的分离效果
Tab.4 Effectofseparationoftheregeneratedsilicagel组分
Caf
EGC6.1189.806
C2.2271.4162.600
EC
EGCG
GCG
ECGTotal/%
原料1.209级份10.0120.00037.8563.19412.94879.3463.2.87510.26765.028
14.22090.8769.46613.52975.460
7.2718.69312.97019.21521.28532.77646.从表3,以下3个优点:
①,简化了工艺流程,且脱除咖啡因效果明显,在该工艺条件下某些级份的咖啡因含量检测为零.
②有效成分含量高.儿茶素总量达到90%,比一般柱层析法高出约20%,其中酯型儿茶素含量超过75%,EGCG最高达到60%,起到了富集酯型儿茶素的作用.
③不同级份之间及同一级份当中酯型儿茶素含量呈抛物线型分布,中间级份酯型儿茶素含量较高,因此可根据市场需求的不同来截取不同的级份来调整茶多酚中酯型儿茶素含量.
硅胶柱吸附分离前后成分变化的HPLC分析结果见图2.
4的结果可知,再生硅胶对粗茶多酚的分离效果基本保持不变,硅胶经再生后可重复使用.
3结论
我国是茶叶资源大国,利用废弃茶末提取具有较高附加值的茶多酚系列产品,特别是医药保健级茶多酚产品,对于调整农业产业结构,综合有效利用农副产品,增加农民收入具有重要意义.自20世纪70年代以来,我国茶叶产区先后建立或改建了近60余家茶多酚生产厂家,但大多数产品质量低,生产成本高,不能满足国际市场对茶多酚越来越高的质量要求.本文采用硅胶为吸附剂,乙酸乙酯为洗脱剂,对粗茶多酚产品进行柱层析法分离精制,精制茶多酚中儿茶素总含量可以达到90%以上,其中酯型儿茶素含量超过75%,EGCG最高可达60%,咖啡因含量可降低至不能检出.该方法操作简便,安全易行,使用成本低,为酯型儿茶素含量高、咖啡因含量低的精制茶多酚的生产应用提供了基础实验数据.参考文献:
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图2 硅胶柱吸附分离前后成分变化的HPLC谱图
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2.HubeiResearchInstituteof,Abstract:Theprocessofpurificationofchromatogra2phywasinvestigated.wasogelasadsorbentandethylacetateas,obtainedwhichthecontentofcatethinwastotalofEGCG,GCGandECGwasover75%,thecon2tentofwasuncheckedbyHPLC.Theresultsshowedthatthismethodwasef2fectiveandsimple.
Keywords:teapolyphenols;caffeine;columnchromatography;silicagel
(上接第542页)
Theoreticalanalysisofthecrystalfield
splitenergyoftheHo3+ioninHoIG
MAShengcan1,YANGJiehui
2
,ZHANGXianzhou1
(1.CollegeofPhysicsandInformationEngineering,HenanNormalUniversity,Xinxiang,Henan453007;
2.PhysicalScienceCollege,LuoyangNormalUniversity,Luoyang,Henan471022)
Abstract:Thecrystalstructureofheavierrareearth2irongarnetHoIGisanalysedandthecrystalfielduponHo3+ionsinHoIGarecalculatedbyusingthecrystalfieldtheory.Andthen,byusingquantumtheorythecrystalfieldsplitlevelsandwavefunctionsofthegroundconfiguration(4f10)5I8oftheHo3+ionsinHoIGarecalculated.Thetheoret2icalresultsareingoodagreementwiththoseofexperiments,andtheseresultscanpro2videagoodbaseforthefuturestudyofthemagnetizationandofthemagneto2opticaleffectsofHo3+ionsinHoIG.
Keywords:heavyrareearth2irongarnetsHoIG;crystalfieldsplit;energylevels;wavef
unctions