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胶原蛋白的鉴别及其杂蛋白检测技术
ＣｏｌｌａｇｅｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｎｇ
ＭｅｔｈｏｄｏｆＩｍｐｕｒｉｔｙＰｒｏｔｅｉｎ
仕生羞矿，冯晓明１’
１）中国药品生物制品检定所，医疗器械检验中心，北京崇文区天坛西里２号１０００５０，中国＋通讯作者：付步芳，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｂｆ３７７＠１６３．ｃｏｒｎ
【摘要】胶原蛋白（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）是一类重要的应用广泛的结构性蛋白质。本文采用ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）来鉴别胶原蛋白及分析杂蛋白含量，通过与胶原蛋白标准品的电泳条带进行比较来鉴别胶原蛋白。利用特异性的胶原酶对胶原蛋白进行酶解，而后检测样品中没有被胶原酶消解的杂蛋白的含量，同时检测实验方法的染色灵敏度，确定杂蛋白的检测Ｆ限。经过多次验证实验表明，在本实验条件下，考马斯亮蓝（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ）对ＢＳＡ的染色极限能达到ｌＯＯｎｇ，含量在０．５％以上的杂蛋白均能被测定。本研究建立了有效的杂蛋白检测技术，为胶原蛋白为基础的生物材料中杂蛋白的检测和监控提供了有效可行的方法。
关键词：胶原蛋白，杂蛋白；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＣｏＨａｇｅｎ
ｉｎｃｏｌｌａｇｅｎｗａｓａｌｓｏ
ｉｓａ
ｋｉｎｄｏｆｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔｅｉｎｕｓｅｄｗｉｄｅｌｙ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｌｌａｇｅｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ａｎｄｉｍｐｕｒｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｔａｉｎｅｄ
ｚｏｎｅｓ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｓａｍｐｌｅ’Ｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ
ｔｏ
ｔｈｏｓｅｏｆｓｔａｎｄａｒｄｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｂｙｕｓｉｎｇｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ
ｎｏｔ
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ｍｏｒｅｔｈａｎ０．５％ｃｏｎｔｅｎｔｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｉｍｐｕｒｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｃｏｌｌａｇｅｎ—
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｌａｇｅｎ；ｉｍｐｕｒｉｔｙｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
前言
对于胶原蛋白的鉴别及其杂蛋白检测，目前尚无标准方法。本文采用ＳＤＳ．聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）来鉴别胶原
胶原蛋白（Ｃｏｌｌａｇｅｎ）广泛存在于动物细胞，是细胞外基质最重要的组成成分，也是动物结缔组织中最主要的一种结构性蛋白质，为生物科技产业最具关键性的原材料之一，其应用领域包括生医材料，化妆品、食品工业、研究用途等。
胶原蛋白是一类蛋白质家族。现已至少发现了３０余种胶原蛋白链的编码基因。可以形成１６种以上的胶原蛋白分子。根据它们在体内的分布和功能特点，目前将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原，间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分。包括Ｉ，ＩＩ、ＩＩＩ型胶原蛋白分子，Ｉ型胶原蛋白是在动物体中发现的一种结构蛋白，是胶原纤维组分中的一部分。它来源于表达在胶原蛋白一链上的ＣＯＬＩＡＩ和ＣＯＬｌＡ２基因。所有的胶原蛋白均具有由三条聚肽链单元组成的三螺旋结构。胶原蛋白富含甘氨酸、Ｌ广丙氨酸、Ｌ广脯氧酸和４＿羟脯氨酸，含少量的硫且不含Ｌ色氨酸。羟脯氨酸是一种胶原蛋白特有的氨基酸，约占胶原蛋白的９％一１３％。杂蛋白是指在胶原蛋白纯化过程中残留的除Ｉ型胶原蛋白外的其它蛋白质。
蛋白及分析杂蛋白含量。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按照分子量大小分离。通过与胶原蛋白标准品的电泳条带进行比较来鉴别胶原蛋白。利用特异性的胶原酶对胶原蛋白进行酶解，而后检测样品中没有被胶原酶消解的杂蛋白的含量，同时检测实验方法的染色灵敏度，确定杂蛋白的检测下限。
材料和方法
１仪器与试剂１．１仪器
（１）天平（２）电泳仪（３）影像分析系统１．２试剂
（１）胶原酶
．．２２２．．
１”Ｉｎｔｅｒｎａｔ！ｏｎａｌｌＧｏｎｆｅｒ冀０９．ｇｏｎＱｕａ＿ｌｉｔ≯Ｇｏｎｔ［ｏ］０３
Ｂｊｐｍａ＿ｔｅｒｉａｌｓａｎｄ，Ｔｉｓｓｕ电ｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐ，ｒｏｄｕｃｔｓ
ｆ２）Ｔ
ｒｔｓ（－Ｋ甲基氰摹Ｖ烷）纯度抽９９％。
Ｉｍ２／ｍＬ。取Ｉ（ＦＯｕＬ瞎＃液々１００ｕＬ２样￡缰１，１，ｉｔｔｆ小玻璃试瞥中混台，此时腔原蛋白敞鹰寿１ｍ￡／ｍＬ（目粜版ｅ变成傲指色时加＾Ｉ－２ｕＬ，－ＩＮＮａＯＨ≈颜色调应《色Ｈ砷定｛统中２ｐＨ）
｛ｆ１００—９０Ｃ热水中１—２丹钟后取出。３】ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ对ＢＳＡ染色
ｆ３）ＳＤＳ（１＝靛售ｍ醴钠）：纯Ⅸ≥９５％。（４）＾水氯化饵分析纯＋音Ⅺ９３％。ｆ５，＝庳台碡艘＝氯触廿析纯．台最９９０ｑ６。ｆ６）丙烯酰畦（Ａｃｚ’ｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ）：敞度４０％ｎ）浪酚兰纯度－＞９８％ｆＨ）甘馘醴含Ⅲ≥９９％。（９）考马斯亮《染ｅ液。（１０）牛血请白Ⅲ白（ＢＳＡ）。
（１】Ｊ丹千嚣标准目：分子ｉ范围３０－３００ｋＤａ。
ｆ１２）鼠建ＩⅫ胺脲蛋自标准＝：鼠尾提取的【璎腔原蛋白（１３ＪＬ醯：舒析纯．冉Ｈ－＞９９５％。ｆ１４Ｊ过硫醴镕（ＡＰＳＪ纯度２９８％。
（１５ＪＨ￥墓‘一＃（ＴＥＭＥＤ）：纯度≥驰【｝％。（１６）氢氧化钠：分析纯，鲁量≥９６０％。
Ｈ油纯度９９％。
扭ｍＨ析
和备７％升扁腔（ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＧｅｌ）目４％敢绵睦（Ｓｔａｃｋｉｎｇ（；ｅ１），舒别取０
０５
ｍ—ｍＬ之ＢＳＡ样８韪】（ＪｐＬ、０００５ｍ—ｍＬ
８
之ＢＳＡ样８涟２０止１０ｐＬ
ｐＬ
６
ｐＬ
４此甚６∞样目讣
１００ｒｉｇ
５０ｒｉｇ
别舔加到６个加样ｎ中，ＢＳＡ的净值讣埘∞５ｌＪ【）ｎｇ
４０ｒｉｇ，３０ｒｉｇ，２０ｒｉｇ，并在后１个加样孔中巾舔加丹ｒｉ标准。ｍ袜电Ⅱ为１１０Ｖ。瑚肜像分析幕皖对脱色后２腔片进行Ｈ析。３．２睦朦蛋白譬跚＆杂噩白分析
２■定步骤２１样＊＊ｄ
¨１０００５
ｍ—ｍｌＢＳＡＭ制：
制备７％丹离胶（ｓｃ口ａ呲ｍ
ｕＣ０５ｍｇｔｍｌ８ＳＡ２０
Ｇｅｌ）和４％浓缩腔ｆＳｔａｃｋｉｎｇ
ａ１１００止２ｎ，ｇ／ｍＬＢＳＡ标准液，枷＾Ｉ（ＨＩＨＬ翘纯小＊台，
拇到Ｉｍ—ｍＬ之ＢＳＡ稀释液｛
Ｇｅｌ），丹＊４取升于Ｅ标准目１０９Ｌ、００５ｍｇ／ｍｌＢＳＡＩ叩Ｌ（５００ｎｇ）
ｈ）取ＩｍｇｈｎＬＢＳＡ稀样液１００儿ｍⅡ＾９００ｇＬ超纯承混台，
得到０Ｉｍｇ／ｍＬＢＳＡ稀祥液【
ｐＬ（１００ｒｉｇ）、样品Ａ（崆原样品）１０儿、样Ｂ
Ｂ（胶胤样品＋腔原酶祸化液）１０此、样＊ｃ（腋原酶诮化液）１０
样孔中。电袜电ｍ勾１１０Ｖ。用影像讣析系统对脱色后的睦“进行舒析。
“Ｌ鼠尾脏原蚩白标准Ｂ如ｕＬ共７份样品分别谁朋到７十加
“取０ｌｍｇ／ｍＬＢＳＡ稀释液ＩＣＯ儿ＤⅡ凡９００ｇＬ超纯承混
台，褂到０，０ＩｍｇｍｎＢＳＡ稀释液
ｄ】取０．０Ｉｍ∥ｍＬＢＳＡ稀释液１００止加人１｛３０ｐ．Ｌ样品缓冲
液（２ｘ）口下１００—９０＇Ｃ热水巾Ｉ一２舒钟后取出．得到
０００５ｍｇ／ｍＬ的ＢＳＡ样“液。ｆ２
Ｊ样＊Ａ【腔缘样目）”日
取０５９
ｆ比币舶当Ｔ１）腔吼饼ｒＪｆ岫咖Ｊ０目ＪｍＬ之ｎＪ％
￡醴十２ｍ［离心昔ｒｈ抓描％台，＆时№原＊白浓度为２ｍｇｔｍＬ。取１００ｕＬ＊衅液与ｌⅢｌｐＬ样８缓Ｈ－液Ｆ驶璃试管中％台，＆时胶腺蛋白浓度为Ｉｍ—ｍＵ如皋鞲色变成微黄色叶，加＾１—２ｐＬ
２ｌＮＮａＯＨ把％色调成蓝色，Ｈ确宅ｇ唬中之ｍＩ），目于ｌ∞一９（１
℃热水中ｌ一２Ｈ钟后舣小。
（卸样＝Ｂ（帔朦样口＋瞳原晦Ｔ自化液）＊目
取０５９肢原Ⅲ白井加＾ＩｍＬ之睦原酶消化液目于１５ｍｌＲ管中，ｆ３７℃水浴锅作用４小时ｆ此时ｍＸ内№ｒ４Ⅲ２残留物），ｎ时扣除所添加之眭原酶所台蛋白质台ｉ后之样“浓度为２ｍ∥
鬣：ＢＳ。Ａ。５”｛：盏篇冀：：黑嚣：怎。
１
”Ｍ目ｃａｋｌ。。矗＾女Ｅ＆ｍ＊＊．
结果和讨论４Ｉ腔原蚩一ｇⅧ
ｚ１１Ｉ，。取１００¨ｒ述样品与１００ｇＬ之样品缓冲液于小破璃Ｈ管
中混台，此时扣除所添加胶脲酶后２样＆敢度１ｍｇ／ｍ１．，口于１０【）一９０Ｃ热水中１ｖ２分钟后取出。
ｒ４）样＊Ｃ｛腔腺酶消化池）＊理
取０．５ｍＬ之越纯水加＾ＩｍＬ之睦娘酶消化渡．混台，取】００¨ｐ迹样Ｂ与１００ｕＬ样Ｂ缓冲液于璇璃Ｈ管巾＊台，Ｒ十１００—９０Ｃ热水巾】～２分钟后取出。
ｆ５）鼠皂Ｊ割腔Ⅲ标准目ｎ４：
称取（】００５９鼠尾Ｉ■睃原标准Ｂ％于】５ｍＬ离。管巾，加＾５ｍＬ２０Ｉ％￡睦，振荔镕解腔原＊ｎ．此¨ｆ腔原§门浓度为
Ａ将脱色后的＆Ｈ在影像仆析系统一Ｉ｜进行扫ｍ¨算丹手口太下１００ｋＤａ以Ｌ的条带密度，样∞Ａ％Ⅲ为Ａ．样＊Ｂ结果
４
脏瓜蛋ｎｍ＊＊带々鼠Ｅ】Ｗ胶原蛋自标准目进ｆｒ比较，＃ｑ掉条带应致。
２杂蛋ｎ分析
＠苞鞋锄燃删台
ｂ）自ＢＣ＇时，样“中＆砸＊ｆ１纯度（％）－ＡｆＢ－（’）ｃ）样目中杂《白古￡（％）＝ｌ∞％，腔胤慑白纯度ｆ＊）小结
＊过每次‰ｉｌ｜ｊ囊验表明．在奉武‰条件ｒ，考乌斯亮蓝（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉａ）ｋｆＢＳＡ的絷色撤ｍ能迅到１００．ｇ．青量在０５％以Ｌ的杂氍自均能性测定，利用腔脲蛋白特有的特Ⅱ枭带通过々标准品比对来对其鉴别足比较简单ｎＩ靠的方法。
ｌ：Ｍ曲ｒｉｅ：Ｍ出ｒ２＋
２＆■＃ａ３：腔原《ｍ￡４：Ｋ
参考文献
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６：ＢＳＡｌｏ吨７：ＢＳＡ・ｍｗ
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ＣｈＰ（中日辨典）２ｆｘ）５ｖ０１Ⅱ（＝部Ｊ＝附录ＩＶＣ
２檗目辕最新丹ｒ生物学蛮∞＆术＃京：科学ｍ版牡第一氍
∞Ｂ样“Ｃ镕ｍ～ｃ，各密嗟以％爱示。
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ａ）ｊＢ－ｃｄ）时，抨＊中胺啄＊白纯废（％）；（Ｉ｛ＸＸＸ）・ＢＳＡ桩ｍ净值Ｊ／Ｌ０（ｍＯ
ｌ“）％
Ｐ３Ｉ３２００Ｌ
胶原蛋白的鉴别及其杂蛋白检测技术
作者：作者单位：
付步芳， 冯晓明
中国药品生物制品检定所,医疗器械检验中心,北京崇文区天坛西里2号 100050,中国
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