专 论
单细胞自由生物基因组全序列的
测定和比较基因组研究
毕高峰 朱立煌
(中国科学院遗传研究所 北京 )
摘要 全基因组序列获得的一些成果, 、基因组分析和新比较基因组等三个方面, 。
关键词 划近几年来取得了很大进展。1995年J . C . V en ter 领导的基因组研究所(T IGR , T he In 2stitu te of Genom ic R eseach ) 完成了第一个单细胞自由生物全基因组分析, 即流感嗜血杆菌(H ae m op op h ilus inf luenz ae R d ) 基因组全序列测定。这项工作也是T IGR 发展的新的测序策略——全基因组鸟枪法测序成功的范例[1]。1996年T IGR 及其合作者用此种基因组测序
coli S ) 的基因组计划将完成, 美丽隐杆线虫
(caenothabd itis eleg ans ) 的基因组计划将于1998年完成[7]。最受瞩目的人类基因组计划(H GP , H um an Genom e P ro ject ) 正如期进行,
以目前的进展速度, 肯定能够于2005年前完成[8]。
以基因组为研究对象的基因组计划是常规的以基因为对象的分子生物学研究的一次飞跃。生物全部基因组信息的获得使得人们开始对生物的认识更为全面更为深入, 从而使基因遗传学跨越到基因组遗传学。
本文试对上述的研究进展的主要成果作一概况的综述。
一、新的测序策略——全基因组鸟枪法测序
T IGR 创立的全基因组鸟枪法测序特别适合
策略又完成了两种生物的基因组全序列测定, 它们是迄今所知的具有最小基因组的单细胞生
物尿殖道支原体(M y cop las m a g en ita lium ) , 和一种不同于原核、真核生物的单细胞生物产甲烷古细菌(M ethanococcus jannasch i ) [2, 3]。其后德国R ichard H err m ann 等发表了肺炎支原体(M y cop las m a p neum on iae ) 基因组全序列的测定分析工作, 与此同时, 历时七年(1989—1996年) 的第一个真核生物酿酒酵母(saccha ro m y ces 日、加、cevev isiae ) 基因组计划在欧共体及美、英等各国实验室共同努力下得以完成[4, 5]。这些生物基因组全序列的完成比人们原先预期的要快得多。T IGR 的工作则被誉为这一领域的一
匹黑马[6]。预计1997年大肠杆菌(E scherich ia . 30
基因组为2M b 以下的微生物的基因组计划。运用该策略对基因组直接进行序列分析, 绕过传统的测序程式中物理图谱的构建, 利用高速计算机完成数量庞大的基因组数据处理工作, 从而能在较短时间内完成基因组全序列的测定[1]。
其基本原理和程序如下:就某个生物的基因组而言, 在对基因组文库全部克隆片段进行末端序列测定中未测到的碱基数, 即缺口
(Gap ) 与测定的总的碱基数有关, 随着测定的
总碱基数的数值增大, 缺口的总碱基数目会迅速减小。其公式是泊松公式的一个推论, 即P =e
一是有模板DNA 但未测序的序列缺口。为此
他们又建立插入片段大小为15220kb 的Κ文库以备缺口填补, 并对Κ文库中的克隆进行末端测序。主要应用4个步骤来填补物理缺口, 包括印迹法, 肽链连接, Κ克隆排序和PCR 确定连锁群测序等。Κ克隆是缺口填补的主要片段来源, Κ文库可以提供一些在小文库中致死的DNA 模板, 并且Κ克隆末端的序列信息非常适合缺口的填补, 填补的, PCR , 用, , T T IGR 2ED I 2OR F , 建立序列的图形交互, 基因组数据集合编辑等工作[1]。
T IGR 创立的随机测序策略使得生物学家可以在短时间内获得生物基因组的全序列信息, 解决了微生物基因组计划中最关键的问题。 二、全基因组序列分析——基因组学的新
内容 全基因组序列是由无标点的线性排列的双链DNA 碱基对组成。如何分析这条DNA 长链, 对获得的全序列进行诠释, 是基因组研究的关键, 即基因组分析。上述五个生物完整基因组计划提供了对基因组全序列进行解读的经验。由于此类工作面对的是庞大的数据, 全部分析必须在计算机上进行, 又称计算机辅助基因组分析[4]。具体有以下内容。
11数据存放。基因组全序列是一庞大的信
。其中P 为基因组中某个碱基未被测定的概率, m 为所测定的碱基数与基因组大小相比的倍数。m 越大P 值越小。由此公式推断m 值达到5时, 即随机测定的碱基数达到基因组5倍时, 基因组中未测定的碱基数为基因组总碱基数的0167%(e -5=010067) 。对于象流感嗜血杆菌这样大的基因组(1183M b ) , 可以推算会产生128个缺口, 每个缺口平均长度为100bp [1]。
根据以上原理, T IGR 采用以下步骤进行全基因组鸟枪法测序:第一, 建立高度随机、入片段大小为2kb 此, 成小片段。大小在116～210kb [1], 产甲烷古细菌插入片段在215kb 左右[3]。所有插入片段都经过琼脂糖凝胶电泳分离回收, 再进行转化。文库中克隆数要达到一定数量, 即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。第二, 高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆, 进行两端测序, T IGR 在完成流感嗜血杆菌的基因组时, 使用了14台测序仪, 用三个月时间完成了必需的28, 463个测序反应, 测序总长度达6倍基因组大小。第三, 序列集合。T IGR 发展了新的软件T IGR —A SSE M BL ER 来完成这部分工作。同时T IGR 修改了序列集合规则, 使形成克隆连锁群(con tig ) 的条件更为严格,
-m
以最大限度地排除错误的连锁匹配。T IGR 2
将A SSE M BL ER 将上万个序列数据进行集合。
各个片段连接成数个连锁群。他们是用内存为512M 的计算机SPA RCen ter 2000完成全部的运算。在集合运算中, 对所有的连锁群都进行了相互的搜索, 以达到最大限度的连锁匹配。第四, 缺口的填补。在序列集合完成之后, 用T IGR 发展的软件A S M 2A SS IGN 将未定位的连锁群进行排序定位, 转换成两种待填补的缺口, 一是没有模板DNA 与之对应的物理缺口,
息。其数据管理是将其存放于计算机网络中的数据库。如T IGR 完成的三种生物存放于
[1, 2, 3]
。肺炎支原体存GD SB (基因组序列数据)
放于GenB ank [4]。由于计算机网络提供的便利, 基因组序列的宝贵资源可以供全世界使用, 任何人通过网络可以在其中对之进行诠释、检查、纠正和补充, 以充实所获得的信息[1]。
21碱基百分含量分析。碱基百分含量的考察是通过软件W I NDOW 进行, 即以一定大小的窗口如5000bp 来对基因组各段进行GC 百分含量的考察[4]。与全基因组平均的GC 百分
31
含量相比, 基因组中不同区域的GC 百分含量并不一致。无论是GC 富含区还是A T 富含区, 都可能是一些特殊功能的区域。肺炎支原体的GC 百分含量高和GC 百分含量低的区域都是开放读码框(OR F ) 密度低的区域[4]。流感嗜血
(9) 调控系统、(10) 复啶、核苷和核苷酸的代谢、
(12) 翻译、(13) 转运蛋白和结合蛋制、(11) 转录、
(14) 其他。这14个类群包括102种生物学功白、
杆菌的GC 富含区有一个隐藏的m u 2噬菌体,
此区GC 百分含量比基因组平均值高[1]。酵母基因组中GC 百分含量高的区域对应染色体的重组值较高的区域, 而A T 含量高的区域对应重组值较低的区域, 包括着丝粒和端粒[5]。尿殖道支原体GC 百分含量最低的区域对应着复制起始点(o ri ) , 而GC 百分含量高的区域对应着
[2]
流感嗜血杆菌GC rRNA 和tRNA 。
高的区域也对应着6个rRNA [1]来看, GC 含量高是构成结构的前提条件[2]31OR F 定之后, 因的功能。首先要找到基因组中全部的OR F 。一般这项工作是借助于软件如FRAM ES 完成[4]。其原理是通过此种生物的已知基因考察其密码表, 设定起始密码子和终止密码子, 再经过计算机分析确定每一个OR F 。其次, 用GEN 2E M A R K
[4]
能。将基因组全部OR F 归入这14个功能类群
中, 再对每一类群的OR F 进行分析。可以对生物的各种代谢过程, 遗传机制, 基本生命所需条件等进行描述, 同时, 还能对此种生物特有的功能如致病性、感染性进行分析[1]。对这五种生物的OR F 分析揭示了许多新的知识, :
(1) 、OR 环() , 它们是柠檬。因此推断流感嗜血杆菌TCA 缺失, 不能合成谷氨酸, 因为谷氨酸的供体是TCA 的中间产生物Α2戊二酸[1]。(2) 、在尿殖道支原体基因组中有一个特殊的OR F , 属于一个重复序列, 称为M gPa 。M gPa 编码29kD 的蛋白质。通过全基因组考察, 共发现有9个与M gPa 同源的重复序列, 这些重复序列之间可以发生重组, 这可诱导尿殖道支原体群体中抗原性改变, 为逃避宿主中的免疫攻击提供条件[2]。(3) 、遗传冗余性是指生物中存在着两套或更多套基因编码同类的蛋白质, 遗传冗余是新基因进化的原材料。酵母染色体端部特有的一个性质就是遗传冗余性。如酵母第三染色体的两端和第五、第十一染色体的端部OR F 的DNA 序列相互之间同源。另外一些着丝粒附近的OR F 也具有同源性。还有两个同源的OR F 编码柠檬酸合成酶等。这些遗传冗余性现象有助于阐明酿酒酵母基因组的进化历程[5]。
41基因组全部遗传信息按一定结构排列在染色体上, 成为一个有机的整体。通过五种生物全基因组序列的研究, 已经获得了关于原核生物和真核生物的染色体结构的一些基本知识。如在原核生物基因组分析中对原核环状基因组的结构单元, 如复制起始位点、重复序列、基因家族和基因调控系统等结构的序列特征已有所了解。从真核酵母的基因组全序列的分析中揭示了真核生物染色体的结构特点, 对真核生物特有的着丝粒序列
来估测每一个OR F 的编码可能。将
每个预计编码序列在蛋白质数据库中进行搜索, 如蛋白质数据库N RB P 和P I R 等, 以严格的匹配原则考察预计编码序列与已存在的蛋白质的同源性。每一个OR F 根据其与已知蛋白质序列的比较结果可以分为三类[1]。一类是通过比较确知其功能的, 另一类是在数据库中有相匹配的蛋白质序列, 但不知其功能。最后一类是在数据库中找不到任何匹配的蛋白质序列。
对第一类, 即已确定功能的OR F 可以按生物功能归类, 以便进行功能分析和基因组之间的比较。T IGR 和R ichard H err m ann 参考R iley 提出的微生物14个生物学功能类群进行OR F 的功能分类[1, 2, 3, 4]。这14个功能类群[1]包括:(1)
(2) 酶、(3) 氨基酸代谢、辅基和转运蛋白的合成、
细胞包装、(4) 细胞进程、(5) 关键中介物代谢、(6) 能量代谢、(7) 脂酸和磷脂代谢、(8) 嘌呤、嘧32
和端粒序列进行了分析。总之, 通过全基因组分析可望阐明生物基因组是如何组织和协调各基因的功能, 以完成生命进程的。 三、比较基因组学的新时代
生物全基因组信息的获得还开辟了比较基因组学的新时代, 使得不同生物之间的比较基因组的研究可以直接在DNA 序列的水平上进行, 从而使我们对生物及生命的了解更为深刻。下面从三方面的工作来阐明这类工作的重要意义。
11最小的有细胞生物——尿殖道支原体基因组
因。, 即T IGR 关于尿殖道支原体与流感嗜血杆菌基因组的比较[2]和H err m ann 关于尿殖道支原体与系统关系较近的肺炎支原体的比较基因组研究[9]。
流感嗜血杆菌的基因组为1183M b , 而尿殖道支原体的基因组只有0158M b , 二者相差3倍多。这就提出了一个问题, 基因组大小到底影响了什么, 是基因数目减少, 还是基因尺度缩小? 通过对两个生物OR F 的考察, 可以看到, 流感嗜血杆菌基因大小平均900bp , 尿殖道支原体的基因为1040bp , 基因大小差不多; 而两者的基因密度也没有明显差异, 流感嗜血杆菌为1个基因 1042bp , 尿殖道支原体为1个基因 1235bp 。可见基因组尺寸减小并不引起基因密度的增加和基因本身尺寸的减小。二者差别在于基因的数目上, 流感嗜血杆菌基因组有1743个OR F , 尿殖道支原体只有470个OR F 。
因编码的蛋白质与系统分化有关。另外还有96个O FR 在基因库中与任何已知序列都不匹配, 可能是此种生物或同类生物的新基因[2]。
H err m ann 对两种支原体的全基因的比较也
许能从另一个角度回答关于最小基因组的问题。已经知道, 两种支原体生活在同一种生活环境中, 具有相同的烧瓶样形态和血清交叉反应。但它们也有不同之处, 如对人类不同组织的不同致病性。从基因组整体比较, 不同, GC 百分含量相差GC %不同的同A T 或GC 在密。基因组组的, 虽然两种生物的基因组都可分为6个区, 但这6个区的次序在两种生物中是不同的, 这与肺炎支原体的基因组的几个重复序列
3、R epM P 1、R epM P 2 R epM P 4和R epM P 5有关。在尿殖道支原体基因组中仅可以看到这些
重复顺序的痕迹, 即前面提到的M gPa 。除R epM P 1外, 其余几个重复序列与M gPa 有高度同源性。由此可以推论尿殖道支原体在这些重复顺序中发生了基因组各区的重组, 这导致两个支原体基因组各区顺序的排列不同。
对两种基因组比较的结果表明肺炎支原体基因组包含着所有尿殖道支原体的OR F 。在基因的组成上二种生物存在值得注意的一致性, 表现在一些功能系统的基因数量和同源性上。这涉及一些基本的生命过程, 如DNA 复制、转录转译、基因表达的调节、蛋白分泌系统和能量保持系统。这些功能系统在两种生物中涉及的基因数量的一致说明尿殖道支原体确实在这些功能上集合了一套最小量的基因, 若再加以减小可能会影响细胞的生存。两种生物类似还表现在几个基因和几种功能在两生物中的共同缺失上。
研究者认为存在于肺炎支原体基因组中的尿殖道支原体没有的遗传信息是解释两种生物学上不同表现的关键, 也是确定最小的自我复制的细胞中必需功能的关键。肺炎支原体有
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对已经确认其功能的OR F , 按功能分类分别对两生物进行比较, 可以看到流感嗜血杆菌分布在各个功能类群的OR F 都多于尿殖道支原体。
尿殖道支原体中有90个已确认功能的OR F 是流感嗜血杆菌所没有的。其中60%基因与格兰氏阳性菌或其他支原体生物同源, 这表明这些基
209个OR F 在尿殖道支原体基因组中不存在(有的OR F 在肺炎支原体的拷贝数比尿殖道
支原体要多, 这可能会引起二者基因组大小的不同但不会引起新的功能的出现) 。这些OR F 重要功能包括h sd 型限制修饰系统、两个磷酸烯醇式丙酮酸:碳氢化物磷酸转移酶系统、NAD P 依赖的乙醇脱氢酶系统以及全套的精胺酸双氢酶生化途径上所有的酶。另外还有一些包含有重复DNA 序列的OR F 。这些OR F 编码的蛋白是导致肺炎支原体具有区别于尿殖道支原体的特性[9]。
尿殖道支原体有已知最小的基因组, 在概因后的最小细胞生物。适当的营养, 存活, 。细胞最小化的研究[9, 10], 其一是通过尿殖道支原体基因组, 逐步减少基因; 另一种途径[10]是现在已尝试的通过对尿殖道支原体与流感嗜血杆菌这两个亲缘关系较远的生物基因组的比较选取其共同的基因(共240个) , 再加上一些其他基因, 最后组成一套含256个基因的最小基因组。后一种途径会因实验条件的控制而使必需基因缺失, 因为一些必需基因在不同生物中并不具有同源性。两种支原体生物基因组的比较则能较好地回答一个最小的、自我复制细胞所必需的功能问题, 因此可以更加准确地了解一个自我复制生物的基因组成, 在此基础上对生命的多样性也会加深了解。
2、既非原核、也非真核的古细菌——古细菌的基因组
产甲烷球菌是高温高压条件下生活的一种自养的单细胞生物。其全基因组序列的测定为全面考察此生物在进化网络上的位置提供了可能。对它的比较基因组研究是借助于与流感嗜血杆菌和尿殖道支原体两种原核生物的全基因组序列, 以及同酵母等真核生物基因组的序列比较进行的。在产甲烷古细胞的基因组中较多的OR F 无法确认其功能, 与现代生物同源性相对较小。一些结论34
只能从已确定功能的OR F 中得出。
比较结果表明, 古细菌产甲烷球菌与原核生物有着共同的染色体组织与结构, 如环状基因组、基因操纵子等, 它在能量产生和固氮方面的基因与原核生物有很高的同源性。产甲烷球菌基因组中20多个编码无机离子运输蛋白的OR F 与细菌的多糖合成酶基因同源, 而且这些基因在基因组中组成基因家族统一调控, 这一点也与原核生物类似。另外产甲烷球菌与细胞至于产甲烷球, 。
, 尤, 以及分泌系统方面与真核生物同源。这说明产甲烷古细菌与真核生物亲缘关系更近。这有以下几方面的证据:
1) 所有的真核生物和原核生物共同具备的核糖体亚单位在产甲烷球菌中都具备, 而且, 古细菌有真核生物特异的核糖体蛋白, 而没有原核生物特异的核糖体蛋白。
2) 翻译延伸因子EF 212, EF 22及氨酰—RNA 合成酶与真核生物有很高的同源性。
3) 11个RNA 合成酶中5个与所有生物同源, 6个只与真核同源。
4) 翻译起始系统与真核生物类似, 而与原核生物区别很大。
5) 在复制系统中, 没有细菌DNA 合成酶I 和流感嗜血杆菌和尿殖道支原体相类似的酶。而具有真核生物Α和ΕDNA 复制酶和细菌DNA 合成酶 , 以及几个与古细菌同源的酶。
6) 在古细菌中发现了5个组蛋白基因, 与真核的组蛋白H 2a , H 2b , H 3和H 4及真核转译相关的CAA T 结合因子CB F 2A 同源, 这表明古细菌在基因表达和DNA 超螺旋动力学方面与真核生物类似。
7) 在产甲烷球菌基因组中一些基因编码内含子蛋白(in tein ) 。
以上比较基因组学提供的结果表明, 在进化系统树上, 古细菌与真核生物亲缘关系比原核生物更近。由此可见, 在自养生物的三个分
支, 细菌、古细菌和真核生物中, 细菌的分化发生较早[5]。
3、最简单的真核生物——酿酒酵母的基因组单细胞真核生物酿酒酵母的基因组大小为12, 068kb , 比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。但酿酒酵母的基因组是最小的真核生物(无论是单细胞还是多细胞生物) 基因组。可见真核生物的生物学复杂性远大于原核生物和古细菌。这可从酿酒酵母与另外四种基因组全序列已测定的生物之间的基因组比较看出。酿酒酵母基因组共有5887个OR F , 这比原核生物和古细菌要多很多。酿酒酵母的基因密度为1个基因 2kb , 和尿殖道支原体等要小。
然而与其它酵母、物的基因组相比, , 其一是基因密度。核生物基因组, 据目前已知的真核生物数据, 酿酒酵母基因组密度高于同类的裂殖酵母(S ch iz osaccha ro m y ces p o m be ) 的基因密度1个基因 213kb 。已知简单的多细胞生物线虫的基因密度为1个基因 6kb , 而人类的基因密度大约为1个基因 30kb 。可见在真核生物中有着与原核生物不同的规律, 即基因组的大小影响基因密度的大小。其二是酿酒酵母只有4%的编码基因有内含子, 而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子[5]。
结 语
基因组计划无论是在方法上还是在生物学基础理论上都取得了很大的成就。从根本上讲, 基因的阐明最终要在基因组中完成。有了基因组的数据, 生物学家可以摆脱以往的由点到面的思路, 从新的角度进行研究。尤为重要的是, 随着各种生物基因组计划的相继完成, 都将在的完成, 与此同时, ]ann R D , A dam M D , W h ite O et al . Science ,
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W hole -genom e Sequenc i ng and the Co m para tive Genom ics
of Free L iv i ng Si ngle Cell Organ is m s
B i Gaofen Zhu L ihuang
(Institute of Genetics , Ch inese A cadem y of Sciences , Beijing 100101)
Abstract F ive genom e p ro jects on single cell m icrobes have been fin ished in recen t years . Som e ach ievem en ts ob tained from these studies are described , including w ho le 2genom e sho tgun sequencing , genom ic analysis , and com parative genom ics . A fu rther discu ssi on is also given on the m ethodo logy of genom e p ro jects .
Key words Genom e p ro ject , W ho le 2genom e sequencing , Genom e analysis , Com parative ge 2nom ics
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