参考文献
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
第一部分 基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成
熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因
组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需
使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3： 42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并
以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加
入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后 溶液
中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，
时间上很合适。 第三部分 修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液 至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果 没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回 收小柱紧密连接后，将 上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻 加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树 脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙 醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以 甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液， 终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后 离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入 这些糖原究 竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵 守文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为 时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下 午，不 妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为 最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小 时，也是可以的，再短就 不敢发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转 一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。 此为洗涤步骤，共2次。
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净， 室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入 20ul-30ulDDW，溶解沉淀。 至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步 实验。
10：-20℃保存DNA溶液。
第四部分 修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下， 但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己 设计引物没有问题。 如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文
献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨 询。查到序列后，一定要和Genbank中的 序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用 的人多否，体系条件 是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是 按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退 火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的 是Takara的LA Taq，很好用，配 有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选 择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据 你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问 题。建议根据文献。
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及 时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也 不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。 这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这 里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛 选克隆这一部分。
第五部分 PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理， 比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。 第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
15ul体系
T-easy 1ul
Ligase 1ul
2xbuffer 7.5ul
DNA 5.5ul
4度，过夜。
2：连接产物的转化
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
3）42度， 90秒钟；
4）冰上2分钟；
5）800ul LB培养基；
6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
后涂：混悬液
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点， 此处自联率较低。
3：取白斑，划种于新板上
新板：先涂：X-gar 35ul
IPTG 25ul
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。 针头挑白斑划2道于板上相应区域内。
37度，孵箱过夜。
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。