水果中诺如病毒检测方法的优化
Hee-Yeon Kima, In-Shin Kwakc, In-Gyun Hwangc, GwangPyo Koa,b
摘要：食品中诺如病毒(NoV)的检测对于食源性诺如病毒引起的爆发性疾病的研究和预防至关重要。然而，目前诺如病毒的检测方法还未有得到很好的检验或优化。本研究中，对不同水果中NoV 的洗脱、PEG 富集病毒以及使用RT-PCR 提取病毒RNA 的各种有效的方法皆进行了优化。首先，对6种不同的缓冲液进行水果表面NoV 病毒的洗脱的方法评估。即将已知量的诺如病毒喷洒于葡萄、草莓、树莓表面，采用蒸馏水、0.05M 甘氨酸-0.14M NaCl(pH 7.5)、2.9%胰蛋白磷酸肉汤-6%甘氨酸、100 mM Tris HCl(pH 9.5)、50mM 甘氨酸-50mM MgCl2(pH 9.5)和3%的牛肉浸出物等6种缓冲液进行洗脱，RT-PCR 检测结果表明：3%的牛肉浸出物对病毒的洗脱效果最佳。其次，对检测诺如病毒最常用的沉淀剂-PEG 分别进行了不同分子量、作用时间和温度等三个因素的进行了评估，结果表明：PEG 10000，4h ，室温条件为最佳。最后，对5种不同的RNA 提取方法进行评估，表明：QIAamp Viral RNA Mini kit提取效果最佳。采用优化后的方法对不同水果总诺如病毒的检测显示，将近6-80%的NoV 病毒粒子可以检出。
关键词：诺如病毒；胃肠炎；水果；洗脱；PEG 沉淀；核酸提取
1. 引言
食物传播性病毒感染是人类疾病的重要因素(Mullendore et al., 2001; Myrmel
et al., 2000)，NoVs 在遗传和抗原上属杯状病毒属(Rutjes et al., 2006)，为人类非细菌性肠胃炎的重要的病原体(Mead et al., 1999; Vinje et al., 1997, 2003)。诺如病毒易感染的场所主要有老人院(Calderon-Margalit et al., 2005) 、医院、游船、学校、餐馆和一些宴席上(Parashar et al., 1998; Rutjes et al.,2006)。
农作物成长阶段的水体污染以及食品加工和包装过程皆可以引起食品感染诺如病毒。诺如病毒感染的典型食物为带生的、未煮熟的肉或海鲜（如贝类）、方便食品以及水果和蔬菜等具有日常消费的食物(Bosch et al., 2001; Daniels et al., 2000; Guevremont et al., 2006; Hutin et al.,1999; Le Guyader et al., 1994; Potasman et al., 2002; Rosenblum et al., 1990; Rutjes et al., 2006)。因为这些食物都缺少热处理，因此都具有很高的感染风险。然而，由于缺乏合理的检测方法以及食物样品取样不便等因素使得诺如病毒引起的食物感
染很少能被检测到(Cliver, 1995)。
进一步的研究表明，葡萄、草莓和树莓等许多水果为许多NoV 感染的基质(Butot et al., 2007; Hill, 2003; Le Guyader et al.,2004)。因此，开发和优化NoV 的检测方法对于预防和调查NoV 的爆发具有重要意义。但是目前检测诺如病毒方法很少，并且限制于某些食物种类，如大部分诺如病毒的检测是针对贝类产品的(Baert et al., 2007; Dubois et al., 2002; Heller et al., 1986; Jaykus et al., 1996; Kingsley and Richards, 2001; Schultz et al., 2007; Shieh et al., 1999; Sunen and Sobsey, 1999)。本研究评估和优化了水果中诺如病毒检测的所有步骤，包括水果中病毒的洗脱、采用PEG 进行病毒的富集以及RNA 的提取。本研究旨在于（1）发现NoV 洗脱的最佳缓冲液，（2）PEG 沉淀病毒的最佳条件，（3）通过RNA 提取对病毒进行洗脱液和沉淀剂进行比较。
2. 方法与材料
2.1粪便样本和RT-PCR 测定
NoV GⅡ-4为引起许多食源性疾病爆发的基因型，检测样本为韩国疾控中心获得的感染诺如病毒的粪便，将其进行一系列的稀释后，采用RT-PCR 进行定量检测。移取以10%悬浮于PBS 中的粪便稀释物140μL，采用QIAmp Viral RNA Mini Kit试剂盒进行病毒RNA 的提取。
RT-PCR 采用靶点病毒基因的衣壳编码区设计两组引物(Isakbaeva et al., 2005)，分别为：G2-SKF 和G2-SKR ，扩增产物为344bp(Kojima et al., 2002)。病毒RNA 的反转录条件为42℃，60min ，然后95℃，15min 激活Taq 酶，94℃ 1min，40℃ 1min，72℃ 1min，共40个循环，最后72℃延伸10min ，每个循环都设阴性对照以控制反应过程。扩增产物以2%的含有EB 的凝胶电泳检测。结果显示，粪便样本中NoV/GⅡ-4的浓度约4×106 RT-PCR/mL，所有的粪便样品储存于-70℃备用。
2.2不同水果中NoV 洗脱缓冲液的优化
本研究共对6种不同的缓冲液进行评估(Baert et al., 2008; Dubois et al., 2002; Guevremont et al., 2006; Lewis and Metcalf, 1988; Monpoeho et al., 2001;Mullendore et al., 2001) ，包括：（1）蒸馏水；（2）3%的牛肉浸出物（pH 7.1）；（3）0.05 M甘氨酸-0.14M NaCl (pH 7.5)；（4）2.9%胰蛋白胨磷酸肉汤-6%甘氨酸；（5）100mM Tris-HCl(pH 9.5)；
（6）50mM MgCl2(pH 9.5)。
首先，取10 μL 4×106 RT-PCR/mL 感染诺如病毒的粪便悬浮液接种到20g 新鲜葡萄、草莓或冷冻树莓中。接种的水果在超净台内静置30 min使得病毒充分吸附，加入上述6
种缓冲液，室温200 rpm孵育5h 。随后加入等体积的氯仿，漩涡震荡混匀，2000g ，4℃
离心10min ，取上清液(Monpoeho et al., 2001)。
然后加入PEG 8000使得上清液的终浓度为8 %，震荡混匀，4℃孵育过夜（不时震荡）。12,000g ，4℃离心30min ，去上清，加2mL PBS重悬浮沉淀。
采用QIAmp Kit试剂盒提取上述悬浮液，然后采用 OneStep PT-PCR kit 进行PCR 扩增。以最后扩增出来的病毒含量与接种到水果表面的病毒含量的比值计算回收率，共做2个平行。
2.3PEG 沉淀剂的优化
对PEG 的优化共进行了3个方面，包括：（1）PEG 的分子量；（2）PEG 沉淀剂作用的时间；（3）PEG 沉淀剂作用的温度。分别采用蒸馏水、3%牛肉浸提物、0.05M 甘氨酸-0.14M NaCl等三种洗脱液加入葡萄、草莓、树莓三种水果， 200rpm 孵育5h 。随后接种10 μL NoV病毒粪便悬浮液（4×104 PT-PCR units）于上述洗脱液中。接种的NoV 病毒粪便悬浮液混合MW 为6000、8000、10000和20000的PEG ，使其在病毒粪便悬浮液中的最终浓度为8%，pH 为7.2。漩涡震荡混匀，室温孵育4h 或4℃过夜。4℃，12000g 离心30min 。去上清，2 mL PBS 悬浮沉淀。将悬浮物进行一系列稀释，进行病毒RNA 的提取以及RT-PCR ，共做三个平行。
将NoV 病毒RNA 进行10倍稀释后采用MPN 法（最大可能数）进行NoV 的定量。将稀释后的样品的PT-PCR 阳性数目与阴性数目参照MPN 表计算病毒RNA 浓度和置信限度(De Man, 1983)。病毒的回收率为PT-PCR 后的病毒量与样本中接种的病毒量之比。 RNA 提取的优化
本研究采用5种不同的方法进行了病毒RNA 的提取分别为：（1）热释放法；（2）硅胶膜法QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)；（3）磁珠法(MagExtractor Viral RNA Purification Kit, Toyobo)；（4）TRIzol 试剂法；（5）免疫磁珠分离法。
待检的葡萄、草莓、树莓三种水果中分别接种10 μL NoV粪便悬浮液，加入3%的牛肉浸出物进行洗脱。洗脱完毕后，加入PEG 10000，4℃孵育4h 。然后采用上述5中方法进行病毒RNA （-80℃备用）的提取，并取2.5 μL的病毒RNA 进行25 μL体系的PT-PCR 反应，每种方法做三个平行。
采用热释放法提取RNA 时，将PEG 沉淀物95℃加热10min 后立即于冰上降温。 磁珠法等方法提取病毒RNA 严格按照MagExtractor Viral RNA Purification Kit试剂盒说明书进行。硅胶膜法提取RNA 采用QIAamp kit，取140 μL RNA加入560 μL的异硫氰酸
盐，再加入等体积的96-100%的乙醇进行中和，然后用QIAamp Mini Column试剂盒进行病毒RNA 的纯化。
采用TRIzol 法提取RNA 时，将PEG 沉淀物以2mL 的PBS 进行悬浮，取淀悬浮液300 μL，加入700μL的TRIzol 试剂，混匀，室温静置5min 。加入150μL的氯仿，震荡混匀，室温静置15min ，4℃，108g 离心15min 。上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，-20℃孵育4 h，4 ℃，10844 g离心30 min，弃滤液。加入1 mL的75 %乙醇洗脱沉淀，晾干后加入15 μL无RNA 酶的水进行溶解。
采用免疫磁化分离法提取NoV RNA，将1 mg/mL的免疫磁珠悬浮液震荡1 min，充分溶解，加入33 μL的磁珠颗粒到磁粉颗粒集中管中，作用2 min直至磁珠移至管的一边，溶液变得澄清。从管的另一边小心移取去清液，使磁珠呈稳定状态。加入0.1M Na- PBS （pH 7.4）室温洗脱磁珠三次后，加入1 mL的0.1M Na-PBS（pH 7.4）（含有5-10 μL的兔病毒衣壳IgG 抗血清），未结合的抗血清用含有牛血清白蛋白（BSA ）的PBS （pH
7.4）4℃洗脱4次进行去除。进行免疫磁化分离的病毒洗脱液加入1/10氯仿进行萃取，PEG 沉淀按上述操作进行，并加入1.5 mL PBS 进行重悬浮。然后将抗体结合免疫磁珠慢慢加入1.5 mL 的上述悬浮液，于MX4混合仪上室温旋转混合1 h 。孵育完成后，采用上述描述的MPC 进行分离，用含有牛血清白蛋白（BSA ）的PBS （pH 7.4）4℃洗脱3次，以50 μL的DEPC 处理水进行重悬浮后移至Eppendorf 管中备用。
2.5 数据分析
PEG 沉淀法比较分析采用方差分析或Kruskal –Wallis 非参量检验。RNA 提取方法的比较采用Mann –Whitney 检验。所有的统计分析的完成均采用SPSS 进行分析，差异显著为p
3. 结果
3.1洗脱缓冲液
采用6种洗脱缓冲液对葡萄、木霉和草莓表面NoV 病毒进行洗脱（表1），结果显示：总体来讲，从葡萄表面洗脱病毒比从草莓表面洗脱病毒的效率高，草莓中NoV 的回收率≤8.5%（最低检测限）。采用50mM 甘氨酸-50mM MgCl 2（pH 9.5）对葡萄表面进行病毒洗脱时病毒回收率最低，而采用蒸馏水、0.05M 甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）、
2.9%胰蛋白磷酸盐-6%甘氨酸均低于最低检测限（8.5%），其中采用3%的牛肉浸提物对葡萄和草莓两种水果病毒洗脱具有最高的病毒回收率。
表1 6种不同的洗脱缓冲液对葡萄和草莓表面NoV 的洗脱效率
洗脱缓冲液
葡萄
蒸馏水
3%牛肉浸提物
0.05M 甘氨酸-0.14M NaCl（pH 7.5）
2.9%胰蛋白磷酸盐-6%甘氨酸
100mM Tris-HCl（pH 9.5）
50mM 甘氨酸-50mM MgCl2（pH 9.5） 总体平均回收率 21 21 21 21 21 17.9 洗脱效率 草莓
a ：洗脱效率为NoV 的回收量与NoV 的接种量的百分比，洗脱效率表示的为双份试验样品的平均值。
b ：低于最低检测限（8.5%）。
3.2 PEG沉淀
PEG 的分子量对于不同洗脱液后NoV 病毒的沉淀效果的影响见表2。四种不同分子量的PEG 沉淀剂的实验结果显示，PEG 10,000的病毒回收率最高，为17.8%，PEG 6000、PEG 8000、PEG 20,000的病毒平均回收率分别为：9.2%、15.5%，其中病毒平均回收率范围为4.3-19.9%，比草莓的检测限（2.6%）低草莓的50.4%，树莓的为6.6-9.4%。PEG 分子量的所有试验结果表明，具有最高回收率的洗脱缓冲液为3%的牛肉浸提物，草莓中病毒回收率最高的为3%牛肉浸提物+ PEG 10,000的病毒回收率最高，但其回收率与其他PEG 的病毒回收率相比没有明显的统计学意义（方差分析试验，p=0.67）。
表2 PEG分子量对于不同洗脱缓冲液洗脱后NoV 沉淀的影响
水果种类 洗脱缓冲液a
6000
葡萄 A
B
草莓 C A
B
C
A
B
C
总计 3.4b (0.4-17.2)c 3.4(0.4-17.2) 7.7(0.9-30.9) 12.9(2.6-39.8) 18(3.4-40.3)
a ：A ：蒸馏水；B ：3%牛肉浸提物；C ：0.05M 甘氨酸-0.14M NaCl
b ：按初始接种量为100%计算NoV 的回收百分率。
c ：95%的置信区间，采用MPN 表对三个独立的实验计算NoV 的病毒回收率。
PEG 沉淀孵育的时间同样也影响NoV 的病毒回收率，见表3。总体来讲，4h 的PEG
孵育时间优于过夜孵育，且无论何种条件下，3%牛肉浸提物为最佳洗脱缓冲液。采用4h 孵育时，分子量低的PEG 的病毒回收率较低，采用3%的牛肉浸提物作为洗脱缓冲液时，PEG 6000和PEG 8000的病毒回收率分别为12.9%和8.6%，PEG 10,000和PEG 20,000的病毒回收率为51.9%和58.4%。然而采用过夜进行PEG 孵育时，病毒回收率最高的为PEG 10,000。Kruskal –Wallis 非参数比较结果表明，过夜进行PEG 孵育和4h 孵育没有显著的统计学意义(P=0.543)。
表3 PEG孵育时间对于不同洗脱缓冲液中NoV 病毒沉淀的影响
PEG MW
6,000 洗脱液a A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C PEG 孵育过夜 草莓 木莓 PEG 孵育4h 草莓 木莓 12.9（2.6-37.8） 12.9（2.6-37.8） 12.9（2.6-37.8） 7.7(0.9-30.9) 9.4(2.6-30.9) 6(0.9-19.7) 3.4(0.4-17.2) 85.8(30.9-100) 3.4(0.4-17.2) 12.9(2.6-37.8) 79.8(12.9-100) 3.4(0.4-17.2)
30 8,000 10,000 20,000 总计 12.9b (2.6-37.8)c 18(3.4-40.3) 3.4(0.4-17.2) 18(3.4-40.3) 9.4(2.6-30.9) 12.9（2.6-37.8）
b:按初始接种量为100%计算NoV 的回收百分率。
c: 95%的置信区间，采用MPN 表对三个独立的实验计算NoV 的病毒回收率。
3.3 RNA提取方法
采用5种不同的病毒RNA 提取方法获得得NoV 回收率见表4，众多方法中，QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA 的病毒回收率最高，其中葡萄的病毒回收率为80%（采用MPN 表指示单位体积初始样品的最近似数），其次依次为热释放法、免疫磁化分离法、磁珠法和TRIzol 法。草莓和木莓的病毒回收率普遍低于葡萄且二者回收率相近，其中采用QIAamp kit法的病毒回收率分别为6%和8%。采用其他的RNA 提取方法，病毒回收率的范围从未检测（TRIzol ）出到8%（热释放法）。一些RNA 的提取方法与它们的回收效率有显著差异（Kruskal –Wallis 检测，p=0.025）。表现出显著性差异的有QIAamp kit 与Toyobo MagExtractor ki（p=0.046）t 和TRIzol 法(p=0.05)之间的差异，然而它与热释放法和免疫磁化分离法无显著差异（p>0.05）。
表4 不同RNA 提取方法对NoV 回收率的影响
RNA 提取方法
QIAampViral
RNA Mini Kit
热释放法 水果 葡萄 草莓 木莓 葡萄
草莓
木莓
葡萄
草莓
木莓
葡萄
草莓
木莓
葡萄
草莓
木莓 a 回收率（%）（95%置信限度） P 值b n/a 0.658 0.046 0.050 0.121 Tpyobo Mag Extract Trizol 试剂法 磁珠免疫分离法 80（12.9-100） 8（0.9-19.7） 6（2.6-9.3） 14（2-42） 8（1-40） 6（1-26） 1.8（0.2-7.2） 1.8（0.2-7.2） 4.2（0.8-9.4） 0.4（0.1-2） 1.5（0.3-4.4）
a ：按初始接种量为100%计算NoV 的回收百分率。其回收率通过查三个独立实验的MPN 表获得。
b ：通过Mann-Whitney 实验评估p 值，以及比较QIAamp Viral RNA Mini Kit和其它核酸提取
的方法。
4. 讨论
尽管NoV 为引起食源性疾病的重要病原之一，但是其在食物中的检测方法的研究尚未成熟。在NoV 爆发的许多案例中，调查者对应于可疑的食物很少能加以辨别确认，原因如下：(Guevremont et al., 2006)（1）可疑食品难以获得；（2）不能采用常规方法对NoV 进行培养；（3）从食物中富集病毒的方法效率较低(Rutjes et al., 2006) 。NoV 不能像其它细菌性食源性病毒一样可以再培养基中培养和浓缩，它既不能在体外培养也不能在体内浓缩。由于这些原因，NoV 的检测和浓缩需要从被污染的食物中进行洗脱后进行浓缩。特别典型的是，食品中NoV 的含量很低，且存在很多化学成分对 NoV 的检测具有抑制作用。众多的因素表明，优化洗脱和浓缩方法对于食品中NoV 的检测具有重要意义。
典型的NoV 检测过程包括：洗脱、PEG 沉淀浓度、RNA 提取和RT-PCR 检测。针对NoV 的检测，多数研究集中于贝类中NoV 的检测，然而，水果和蔬菜亦是食源性疾病爆发性多的种类之一(Butot et al., 2007)，因此从不同水果中评价NoV 的回收率及其重要。本研究则对不同水果中NoV 的洗脱、浓缩和提取进行了优化。
为检验洗脱液的洗脱效率，本研究对已有研究中用到的所有洗脱缓冲液进行了检测
(Baert et al., 2008;Dubois et al., 2002; Guevremont et al., 2006; Lewis and Metcalf,1988; Monpoeho et al., 2001; Mullendore et al., 2001)。在所检测的6种洗脱缓冲液中，3%的牛肉浸提物对于NoV 的洗脱效率最高，可能是其具有高的浓缩蛋白造成的。从目前草莓和速冻树莓中NoV 的洗脱效率的研究显示，100mM Tris 缓冲液的洗脱效率范围为0.42%-11.2(Butot et al., 2007) ，本研究洗脱效率为8.5%，与其研究结果一致。Tirs 缓冲液中加入1%的牛肉浸提物对草莓和树莓的病毒洗脱率分别提高了2.2和3.6倍。这个结果与目前关于浆果中牛肉浸提物的特定蛋白可促进NoV 的洗脱的研究结果相一致。
本研究对于PEG MW 和孵育时间对于病毒沉淀的影响首次进行了研究，PEG 由于其快速和温和的方法应用浓缩病毒，能够在中性pH 值和不含其它化学物质的高离子浓度的溶液中作用(Lewis and Metcalf, 1988)。尽管怀疑增加PEG MW可能会增加NoV 从洗脱液中的回收率，但本研究结果不支持这个观点，且认为延长PEG 的孵育时间对于提高病毒回收率毫无意义。本研究采用PEG 沉淀病毒的回收率为12.4%，低于已有研究的甲肝病毒回收率（13-27%）(Mullendore et al., 2001)，但是高于已有研究的NoV 的回收率（1-7%）(Butot et al., 2007; Rutjes et al., 2006)。这种不同可能是由于洗脱缓冲液中蛋白质和其它成分的不同引起的结果。本研究采用3%牛肉浸提物进行病毒洗脱后进行PEG 沉淀具有很高的效率，可能是由于牛肉浸提物中的高浓缩蛋白促进了PRG 对于NoV 的絮凝作用。
食品中有许多成分对分子检测如PT-PCR 具有抑制作用(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab and McDevitt, 2003)。这个问题在浆果（如草莓、木莓等）检测中尤为显著，其 主要原因为检测过程中存在化学抑制剂和浆果比较低的pH 值(Lewis and Metcalf, 1988; Schwab and McDevitt, 2003)。迄今为止，NoV 被认为是少量蔬菜和水果中存在的天然病
洗脱（21-85%回收）
图1 水果中NoV 的检测方法的优化和用于病毒检测的样品回收量
毒(Calder et al., 2003; Hernández et al., 1997; Kobayashi et al., 2004; Le Guyader et al., 2004) 。本研究病毒检测的操作过程包括：3%的牛肉浸提物进行病毒洗脱、PEG 10,000室温孵育4h 、QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA 、水果中NoV 的检测（图1）。 已有的研究认为牛肉浸提物中含有许多PT-PCR 抑制剂(Katayama et al., 2002; Schwab and McDevitt, 2003) ，但是在本研究中未发现有明显的PT-PCR 抑制因子，其原因可能为由病毒RNA 提取过程中抑制因子已被有效去除。
本研究共评估了5种NoV 中提取RNA 的方法，评价病毒RNA 提取方法的因素包括该提取方法与先前洗脱和浓缩步骤的相容性、从先前病毒颗粒中提取RNA 的效率和PT-PCR 抑制剂去除的能力。本研究对没一种RNA 提取方法都进行了测试，其中采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的病毒回收最高，其次为免疫磁化分离法。然而，免疫磁化分离法提取的效率取决于所使用抗-NoV 抗体的类型和质量，抗体抵抗不同类型的NoV 的确认试验需进行进一步研究。
尽管本研究采用PT-PCR 进行NoV 的检测，但是其他的一些分析检测方法，如电镜检测方法或酶联免疫方法皆可进行使用。众多NoV 检测方法中，PT-PCR 由于其快速和高灵敏性和特异性，为最通用的检测方法。本研究通过一系列稀释和常规PT-PCR 检测进行病毒回收率的量化，但是更多的定量方法如实时PT-PCR 检测应该用于取代RT-PCR 。
目前的方法的一个局限性在于由于分析检测不能区分感染性病毒和非感染性病毒
的区别，故未能提供NoV 感染率的相关信息（Straub et al. (2007)。目前已有一种NoV 的体外三维培养系统，但是该系统的以应用比较困难和昂贵，且仅有一部分类型的NoV 可以采用该种方法进行培养。除此之外，鼠类诺如病毒（MNV ）亦可作为人类NoV 研究的替代品，MNV 容易培养并采用RAW264.7细胞系进行菌斑实验，该方法可以实现病毒感染性的量化(Karst et al., 2003;Thackray et al., 2007)。然而，MNV 表现为不同的特征，且替代品病毒具有局限性。因此，研究与PT-PCR 检测相一致的病毒洗脱和浓缩方法具有很重要的现实意义。
目前，尚未有不同NoV 感染水果的标准化的检测方法，鉴于NoV 在食源性疾病中的重要性，评价和优化食品中NoV 的检测方法具有重要意义。本研究中优化的NoV 检测的操作步骤可用于NoV 相关的疾病爆发性检测。该方法对于食源性疾病的调查和食品的监测极其重要，下一个研究方向为其它重要食品基质中病毒洗脱和浓缩等操作条件的优化。
致献
本研究部分基金来自韩国食品和药品管理局（授权#06042）。
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