醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白目的和要求? 目的和要求? 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法 原理? 原理? 带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为电泳 其移动方向及速度取 电泳， 电泳 决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度以及溶液 pH 等因素。蛋白质分子在 溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的可解离基团如-COOH、-NH2、-OH 等， 因而在某种 pH 值溶液中蛋白质分子带有一定的电荷。混合蛋白样品中由于各蛋 白质的等电点不同，在同一 pH 溶液中所带的电荷性质及电荷数目不同，因此在 电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。 血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和 γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立 体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。由下表可见，血清中 5 种蛋白质的等电点大多低于 pH7.0， pH8.6 的缓冲液中都电离成负离子(羧基解 在 离)，故在电场中均向阳极移动。 蛋白质种类 清/白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 等电点(pI) 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.50 相对分子量(Mr) 69 000 200 000 300 000 90 000~150 000 156 000~300 000 在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带 剪下，分别用 0.4 mol/L NaOH 溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直 接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。 本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。 醋酸纤维素 是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮、氯 仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂
成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后即可。该膜 具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为 120 ?m。? 醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附 现象等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球 蛋白和同工酶的分离及测定。 操作步骤? 操作步骤? 准备? 一 准备? 醋酸纤维薄膜的润湿和选择：将薄膜裁成 8×2cm 状，使其漂在缓冲液液面 上(若迅速湿润，整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀，可用于电泳实 验)，然后用竹夹/镊子轻轻地将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用 (约 0.5h)。? 制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边并用虹吸管平衡两边液面。根据电 泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条。取四层附着在电泳槽的支架上，使其 一端与支架的前沿对齐，另一端则浸入电极槽的缓冲液内。然后用缓冲液将滤纸 全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法， 在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。 它们的作用是联系醋酸纤维薄膜 和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。 点样? 二 点样? 取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间吸去多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板 上(无光泽面朝上)， 用点样器蘸取适量血清(约 2~3 ?l)， 再“印”在薄膜的点样区(距 薄膜一端 1.5 cm 处)。血清应均匀分布，形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。 点样切忌过量，可事先在滤纸上练习以掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的 电泳图谱的重要环节之一。? 电泳? 三 电泳? 将点好样的薄膜(无光泽面朝下)两端紧贴在支架的滤纸桥上(加血清端靠负 极)，中部
保持悬空平直。先平衡 10 min，仔细检查电泳装置的线路是否正确， 然后通电。打开电源开关，调节电流为 0.4~0.6 mA (薄膜每厘米宽)，电压为每厘 米长 10~12V。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高偏低。待 电泳区带展开约 3~5 cm 时，关闭电源，一般通电时间为 60 min 左右。? 染色? 四 染色 电泳结束后， 关闭电源， 立即取出薄膜， 直接浸入染色液中， 染色 5~10 min。 然后用漂洗液漂洗至背景无色(约 3~5 次)。再浸于蒸馏水中或用滤纸吸干。 结果判断? 五 结果判断 一般经染色漂洗后，薄膜上可呈现 5 条区带，由正极端起，依次为清蛋白、 α1 球蛋白、α2 球蛋白、β 球蛋白、γ 球蛋白。 试剂和器材? 试剂和器材试剂? 试剂? 1. 新鲜血清(制备时要无溶血现象)? 2. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6， 0.075mol/L， 离子强度 0.06)： 称取巴比妥 1.66g 和巴比妥钠 12.76g，溶于少量蒸馏水后定容至 1,000mL。? 称取氨基黑 10B 0.5g， 加入蒸馏水 40 mL， 甲醇 50 mL 和冰醋酸 10 mL， 3. 染色液： 混匀，贮存于试剂瓶中。? 4. 漂洗液：取 95%乙醇 45 mL，冰醋酸 5 mL 和蒸馏水 50 mL，混匀。? 器材? 器材 醋酸纤维薄膜：市售的电泳用醋酸纤维薄膜 培养皿(直径 9~10 cm) 点样器/血色素吸管 直尺和铅笔 电泳仪和电泳槽 镊子 普通滤纸 试管和试管架 思考题? 思考题? 1. 点样为什么要在粗糙面？电泳时为什么点样面要向下放置？ 2. 如果区带的分离效果不好，试分析可能存在有哪些因素的影响？