农业微生物制剂的活性菌分离与鉴定
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中国·大庆
2013 年 6 月
农业微生物制剂的活性菌分离与鉴定
摘要：微生物制剂是以自然界中分离的有益菌为主体开发的产品，在健康、环保及农业生产上应用广泛。某农业微生物制剂在海南的热带农业生产中能显著增产和增强作物抗性，为了了解该微生物制剂的作用机制，本研究采用平板划线法对活性菌进行分离和纯化，对分离菌株进行生长、形态及显微观察，对16S rDNA 进行序列PCR 扩增、测序及生物信息学分析，鉴定活性菌的种属。结果表明，分离得到2个形态不同的细菌菌株，通过形态观察及16S rDNA 序列的分子鉴定，发现这2个菌株与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有99.9%的同源性；2 个菌株的16S rDNA 序列的比较结果发现它们有7个碱基的差别，说明这2个菌株可能是不同的生理小种。
关键词：农业微生物制剂；活性菌分离；16S rDNA；分子鉴定
Isolation and identification of active bacteria from agricultural
microbial agents
Abstract：Microbial agents are useful products made of beneficial bacteria that isolated from nature environment, and it was extensively applied to healthcare, environment protection and agricultural production. A microbial agent has significant effects on increasing yield and improving disease resistance for Hainan tropical agriculture. In order to discover the activity mechanism of this microbial agent, it was necessary to isolate and identify its active bacteria. In this research, the following methods were applied, including active bacteria isolating and purifying, growth observation, morphological and microscopic observation, PCR amplification of 16S rDNA, sequencing and bioinformatic analysis. The results showed that two bacterial strains with different morphological character were isolated,16S rDNA sequences were amplified and sequenced，bioinformatic analysis indicated that 16S rDNA sequences of the two strains had 99.9% identities with that of Bacillus subtilis. Moreover, the 16S rDNA sequences of the two strains were compared with each other, and 7 base differences were found, it indicated that the two strains were different physiological races of Bacillus subtilis.
Key words： agricultural microbial agents; isolation of active bacteria; 16S rDNA; molecular identification
前言
随着科技进步， 发展有机农业和生态农业是大势所趋[1-2]，农业微生物制剂在农业生产中正发挥着越来越重要的作用。农业微生物制剂通常含有单一或多种特定的功能菌株，能为植物提供有效养分或防治植物病虫害，并在保持土壤肥力、提高化肥利用率、促进作物生长、拮抗土传病害、维持生态系统平衡等方面起重要作用[3-4]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是微生物制剂中的常用菌类之一，为革兰氏阳性需氧菌，无荚膜，有鞭毛，能活动，芽孢位于菌体中央或稍偏，广泛分布在土壤及腐败的有机物中。枯草芽孢杆菌在农业病害的生物防治上具有很大的潜力，菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对几十种真菌、细菌和病毒性病害有明显的抑制和杀灭作用， 具有净化土壤环境、保护作物根系、减轻土传病害的发生的作用[5-6]。枯草芽孢杆菌对外界有害因子的抵抗力强、分布广、耐热性好，是理想的生防菌对象，目前全世界收集保存了几百株野生型枯草芽孢杆菌菌株， 能够产生40 多种具有不同结构的抗菌物质。香蕉枯萎病影响全球香蕉种植业的发展，采用拮抗细菌来对香蕉枯萎病进行防治成为人们研究的热点，徐雪莲等[7]从红树林中分离得到2 株对香蕉枯萎病有抑制作用的内生芽孢杆菌菌株。
本研究对具有增产和抗病效果的某农业微生物制剂中的活性菌进行分离纯化、形态观察和分子鉴定，以研究微生物制剂中活性菌的组成情况。 1 材料与方法
1.1 试验材料
某农业微生物制剂、高压灭菌器、超净工作台、恒温培养箱、高速冷冻离心机、PCR 仪、各种型号移液器、电泳系统、凝胶成像系统。Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等均购自上海生物工程有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 活性菌的分离与纯化
分离活性菌采用涂布分离法，LB 培养基配方参照《植病研究方法》[8]。将培养皿、蒸馏水、培养基等用品在0.103 Mpa、121℃条件下高压蒸气灭菌20 min；在超净工作台进行无菌操作，每皿约含15 mL培养基，待其冷却凝固。取约0.1 g 微生物制剂粉末放入1.5 mLEP 管中，加1 mL无菌水配成悬浮液，然后依次稀释成10-1 、10-2、10-3、10-4 的样液。取上述样液用涂布法分别划线接种到4 个培养皿中，用封口膜将培养皿密封，标注日期及对应编号，37℃恒温培养箱中培养观察。挑取单克隆进行纯化培养，并对纯化的菌落进行形态观察和显微观察。
1.2.2 CTAB 法提取细菌DNA及电泳检测
采用改良CTAB 法（1.7％ CTAB，1.17 mmol/L NaCl，17.5 mmol/LEDTA，80
mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1％β-巯基乙醇），小量法提取细菌基因组DNA[9]。刮取纯化培养的菌体约0.2 g，收集在1.5 mL EP 管中，加入1 mL CTAB 抽提液，充分混匀，65℃温育30 min，中间摇匀2 次；加入等体积的V氯仿：V 异戊醇=24∶1 混匀，12 000 r/min 离心10 min，取上清，重复1 次；上清中加入等体积异丙醇，混匀静置5 min，12 000r/min 离心10 min；弃上清，得DNA 沉淀，用75%乙醇清洗2 次， 稍晾干后用TE 溶解。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性，用紫外分光光度计测定DNA 浓度，保存于-20℃备用。
1.2.3 PCR 扩增与电泳检测
以提取的细菌DNA 为模板，对16S rDNA 的基因进行扩增，引物序列为16S rDNAF(5’ATCGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)、16S rDNA-R [10]。PCR 反应体系为20 μL，包括：2 μL 10×Buffer、0.3 μL dNTP (10 mmol/L)、Taq DNA 聚合酶1 U、0.8 μL 引物（10 μmol/L）、DNA 模板40 ng。PCR 反应程序为：95℃ 5 min，1 个循环；95℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 10 min，1 个循环；4℃保存终止反应。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在Gel-2000 凝胶成像系统（Bio-Rad 公司）观察记录。
1.2.4 16S rDNA 序列的测序及生物信息分析
将PCR产物条带切胶回收纯化，与pGEM-T 载体连接，42℃热击法转化感受态细胞DH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白斑菌落转化子， 通过菌落PCR 验证阳性克隆， 将阳性克隆摇菌，送上海生物工程公司测序。将测序结果通过BLASTn软件与GenBank 中的NR 核酸数据库进行序列相似性检索，通过比较与已知序列信息的同源程度，推测16S rDNA 序列代表的细菌种属。
2 结果与分析
2.1 活性菌的分离纯化与观察
通过分离纯化，从微生物制剂中分离得到2个菌株，2个菌株的共同点是菌落表面粗糙不透明、污白色或微黄色。2个菌株在菌落形态上也存在一些差异，1 号菌的菌斑边缘光滑，2 号菌的菌斑边缘呈锯齿状（图1）。对2个菌株进行革兰氏染色观察，发现革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，染色时着色均匀，能活动。2 个菌株在显微镜下没有观察到形态上的显著差异。
2.2 16S rDNA 序列的PCR 扩增
分别提取2个菌株DNA，对16S rDNA 序列进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2 所示，可见1 号菌株（K01）和2号菌株（K02）的PCR 产物都在1 500 bp 左右，条带清晰唯一，可进行后续试验。
2.3 重组子的菌液PCR 鉴定
将1号和2号菌株的16S rDNA 的PCR 产物切胶回收，与T 载体连接，转化大
肠杆菌DH5α，经过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，摇菌，用16S rDNA 的引物对菌液重新进行PCR扩增，电泳检测结果如图3所示。结果表明，阳性克隆的PCR 产物大小在1500bp左右，与预期的结果相符。
2.4 测序及生物信息学分析
将阳性克隆的菌液送到上海生物工程公司测序。测序得到1 号菌的序列全长1 518 bp，通过NCBI 网站进行生物信息学分析，通过BLASTn 检索，得知1 号菌的16SrDNA 序列与枯草芽孢杆菌基因组（AL009126.3，Bacillus subtilis supsp ste.168 complete genome） 的相似程度为99.67%。测序得到的2 号菌株的序列全长1 519 bp，通过NCBI 网站进行生物信息学分析，通过BLASTn 检索，得知1 号菌的16S rDNA 序列与枯草芽孢杆菌基因组（AL009126.3，Bacillus subtilis supsp ste.168 complete genome）的相似程度为99.87%。
2.5 菌株之间16S rDNA 序列的比较
通过NCBI 网站BLASTn 平台的bl2seq 程序，对1 号菌株和2 号菌株的16S rDNA 序列进行双序列比较，结果表明，两个菌株的16S rDNA 序列，有1 512 个碱基是一致的，有7 个碱基位点存在差异（图4）。由于这2 个菌株在菌落形态方面有差异，16S rDNA 的序列从分子水平进一步验证了这种差异， 说明这2 个菌株可能是枯草芽孢杆菌的两个不同生理小种。
3 结论与讨论
16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基16S rRNA的基因，长度约为1 500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”， 其序列包含10 个可变区（variable region）和11 个恒定区（constant region）。可变区因细菌种类而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，现代细菌分类学以此作为重要的分类依据[10]。16S rDNA 的保守性使应用单一方法进行细菌的统一检测成为可能， 基因诊断的灵敏度高、快速准确。
参考文献
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