第四章 紫外可见分光光度法（UV-VIS）
紫外可见光谱法简介: 以分子的外层电子吸收紫外可见光，在分子的电子能级发生跃迁为基础的分析方法;使用材料简单 ，仪器造价低;广泛用于有机物的定量分析
原理：分子光谱简介;紫外光谱吸收曲线;各类有机分子紫外光谱
仪器：主要部件 ：光源、单色器、吸收池、检测器 仪器类型：单光束、双光束、双波长 应用：结构分析：分子骨架推断 定量分析：多组分分析 一、分子光谱
电子光谱 紫外可见光谱，能级差一般约为1-20eV。 振转光谱 红外光谱，能级差一般约为0.05-1eV。
三、各类有机化合物的光谱
两个术语（生色团、助色团） 饱和烃及其衍生物 不饱和烃和共轭烯烃 羰基化合物 苯及其衍生物 稠环芳香烃和杂环化合物
生色团：能吸收紫外可见光产生电子跃迁的原子基团或结构体系称作生色团。
助色团：本身不吸收紫外可见光，但是当与生色团相连时，则会使其吸收增强，λmax向长波方向移动，这些基团称为助色团。
饱和烃及其衍生物: 饱和烃：σ→σ*跃迁，λmax
不饱和烃和共轭烯烃: 不饱和烃会产生π→π*跃迁，在不饱和烃中，如果有两个以上的双键共轭，随着共轭体系的加长，π→π*跃迁吸收带明显向长波方向移动，而且强度大大增强。
不饱和烃和共轭烯烃
共轭体系λε
max/nmmax
羰基化合物
羰基化合物含有>C=O基团，包括醛、酮、羧酸、酯、酰胺、酰卤、酸酐等。π→π* 跃迁：K带
（220nm，εmax约104）n→π*跃迁：R带（320nm，εmax约102）
苯及其衍生物
苯：π→π*跃迁，由于苯的特殊结构，有3个吸收带，
180nm、105，210nm、104，260nm、102。
苯的衍生物：有助色团，第三个吸收带增强，向长波移动。
C=C-C=C
2172.1*104
C=C-C=C-C=C
2684.3*104
C=C-C=C-C=C-C=C
3048.1*104
共轭体系λε
max/nmmax
C=C-C=C-C=C-C=C-C=C
334
1.21*105
C=C-C=C-C=C-C=C-C=C-C=C
364
1.58*105
稠环芳香烃和杂环化合物: 稠环芳香烃：均显示苯环的三个吸收带，而且随环数的增加，λmax向长波方向移动越多，εmax也越大。杂环化合物：谱图与相应的碳环化合物谱图类似 ，需考虑助色团效应。
一、主要部件
光源
操作谱区内，能发射连续的、具有足够强度和稳定的辐射。
可见区：白炽光源紫外区：低压直流氢灯
单色器
选择波长，进行扫描或者进
行定量分析。
可防止强光照射引起吸收池
中一些物质的分解。
吸收池（参比池）: 能透过有关辐射，可见区用玻璃，紫外区用石英。常用的吸收池厚度（即b值）为1cm，最长的10cm，最短的0.1mm。
检测器: UV-VIS对检测器的要求有：灵敏度高、与辐射强度成线性响应、响应时间短、稳定性好、噪音较低。 常用检测器为光电倍增管。 二、仪器类型
单波长单光束:从光源发出的一束光，经过单色器，依次通过参比池和样品池分两次测定I0 和I ，计算A。结构简单，应用广泛；不稳定，误差较大，需经常校正零点。
单波长单光束示意图
二、仪器类型
单波长双光束
光源发出的光，经单色器，分成相同的两束，分别通过参比池和样品池，交替进入检测器，一次检测得到吸光度。
能消除光源不稳定带来的影响。
单波长双光束示意图
双波长:光源发出的光，经两个不同的单色器，得到λ1和λ2两束光，交替通过吸收池和检测器。消除了吸收池参数、位置、污垢程度及参比溶液带来的误差。精确度高。用于多组分、高浓度、浑浊样品测定。
导数光谱曲线: 保持双波长分光光度计两束光的Δλ为1-2nm，进行扫描，可得到dA-dλ的一阶导数光谱曲线。具有如下优点：分辨重叠的峰;分辨被强峰掩盖的弱峰;确认宽吸收带的最大吸收波长. 经验规则计算λmax: Woodward规则:用于计算母体为共轭烯烃、烯酮类化合物的λmax;Scott规则:用于计算母体为芳香族羰基衍生物的λmax
一、结构分析
由于特征性差，UV-VIS应用于结构分析有局限性，仅用于两个方面：
鉴定生色团种类辅助确定分子结构
辅助确定分子结构
其他方法判断出某化合物的几种可能结构时，UV-VIS可以进一步确定结构。
经验规则计算λmax，与实测值比
较。
比较吸收曲线。
Woodward规则
母体异环二烯214nm三个取代烷基3*5=15一个环外双键1*5=5计算值 234nm实测值 234nm
Woodward规则
母体共轭烯酮215nm烷氧基连羰基 -22α取代烷基 10β取代烷氧基 30计算值 233nm实测值 236nm
Scott规则
母体苯酮类 246nm间位羟基 7对位羟基 25计算值 278nm实测值 279nm
比较吸收曲线: 化学法推测大麻二醇的结构可能为下面某一种：
将其吸收曲线与下列两种化合物的曲线比较，发现与前者相似而与后者差异较大。
二、定量分析
UV-VIS定量分析的理论依据就是朗伯比尔定律：A =εb c 单一组分的测定比较简单，这里重点介绍双组分的测定。双组分吸收曲线有三种关系：不重叠、半重叠、全重叠。
不重叠
二者在对方的最大吸收处均无吸收，可以当作两种单一组分进行测定。
半重叠
先测定不受干扰的组分，再根据吸光度的加和性（A=AX+AY），测定另一组分。
全重叠
干扰严重，需用联立解方程组法。
联立解方程组法: 测定混合物在λ1和λ2的吸光度，根据吸光度的加和性原则，则可以建立一个二元一次方程组。
XXYYA1bcbc11XXYYA2bcbc22
三、实际应用
UV-VIS在农业和生物学上可用于测定色素、蛋白质、核酸、激素、农药、肥料、饲料、土壤、植物营养及农产品品质分析等。
测定叶绿素a、b的含量: 叶片色素的85%丙酮提取液中叶绿素a、b的含量（ca、cb，单位用ng/L）可用Armon公式计算，吸收池的厚度b=1cm，则：Ca = 12.72A663 – 2.58A645 Cb = 22.87A645 – 4.67A663
测定蛋白质（280nm）
苯丙氨酸色氨酸酪氨酸
测定核酸（260nm）
325nm
测定维生素
维生素A维生素B1242nm维生素B6
265nm
测定维生素
维生素C
测定维生素
维生素E
维生素D
其他分析: 无机元素：和显色剂反应;食品添加剂和污染物;表面活性剂（洗涤、化妆、祛臭剂）;鞣剂（皮革工业）