第19卷 第6期 2017 年 6 月
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
辽宁中医药大学学报
Vol. 19 No. 6 Jun .，2017
DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2017.06.014
钩藤生物碱闪式提取工艺研究
王海波，邸学，谭超元
（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）
目的：确定闪式提取钩藤药材生物碱成分的最佳工艺条件。方法：运用均匀试验设计，以提取液中去摘 要：
氢钩藤碱、异去氢钩藤碱含量及出膏率为指标，采取多指标综合评分法结合主成分分析，对闪式提取的影响因素进行考察。结果：闪式提取的最佳工艺是：将钩藤药材粉碎，加入75％乙醇溶剂的料液比为1：50，提取时间50 s；出膏率10.1%，两种生物碱成分总量0.53 mg/g。结论：采取闪式提取法进行钩藤生物碱的提取，提取效率高，提取工艺操作简便、快速，更利于保持钩藤生物碱类成分稳定。
关键词：闪式提取；钩藤；生物碱；均匀设计
(2017) 06- 中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1673-842X 0051- 03
Optimizing Homogenate Extraction Process for Alkaloids of
Ramulus Uncariae by Uniform DesignWANG Haibo，DI Xue，TAN Chaoyuan
（Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，Liaoning，China）
Abstract：Objective：The research aimed to optimize the extraction techniques for Ramulus Uncariae
Cum Uncis with homogenate extraction. Methods：The extraction techniques was optimized by multi-index text comprehensive scoring method and principal component analysis，the use of uniform design，which took the extraction rate of corynoxeine content，isocorynoxeine content and rate of creaming as indices. Results：The optimum extracting procedure was extracting 50 s，using 50 times volume of 75% alcohol. Conclusion：The extraction technique is simple and quick，with high extracting rate.
Keywords：homogenate extraction；Ramulus Uncariae Cum Uncis；alkaloid；uniform design
中药钩藤为茜草科植物钩藤 Uncaria
rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil.（UR），大叶钩藤 U. macrophylla（Miq.）Miq. ex Havil.（UM），毛钩藤 U. hirsuta Havil.（UH），华钩藤 U. sinensis（Oliv.）Havil.（USi）及无柄果钩藤 U. sessilifructus 秋丽等[10]利用电泳和质谱等分离分析手段比较多肽组分的化学性质，结果表明梅花鹿茸和马鹿茸多肽、新西兰赤鹿茸多肽的的电泳图谱和质谱有明显差异，其对不同基源的鹿茸多肽研究对本实验不同基源的鹿茸大分子蛋白的区别有一定研究依据。本实验填补了不同种鹿茸蛋白的横向比较的空白，对市场上主要流通的两种鹿茸混淆品进行电泳分析，初步对不同品种鹿茸蛋白的分子量差别进行比较，结合相关文献确定了分析鹿茸蛋白的电泳方法，为下一步鹿茸蛋白的研究和鹿茸品种的鉴定奠定了基础。◆
参考文献
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Roxb.（USe）的干燥带钩茎枝，是中医治疗肝风内
动、小儿惊痫抽搐要药，在治疗使用时常采用“后下”的煎煮方法。研究中常采用煎煮法、索氏提取、乙醇回流提取、超声法、渗漉法、冷浸法[1-4]等提取方法。钩藤主要有效成分为吲哚及氧化吲哚类生
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收稿日期：2016-11-03基金项目：国家自然科学基金项目（81102789）；辽宁中医药大学杏林杰出青年基金项目（JQ20081228）作者简介：王海波（1977-），男，辽宁沈阳人，副教授，博士，研究方向：中药药效物质分析评价研究。
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物碱，该类成分极易受热转化，在生产提取时，回流提取、煎煮等加热提取会造成生物碱类成分发生转化。索氏提取、渗漉、冷浸等方法都存在着提取时间长、溶剂消耗大、提取效率不高、操作繁琐等问题。
近年来快速发展的闪式提取速度很快。闪式提取是根据组织破坏学设计的一种新型提取技术，其主要原理是在适当溶剂存在下，利用高速机械剪切力和搅拌力使药材快速破碎至适当粒度并同时伴有剧烈搅拌、振动、负压渗透等方式影响，能够迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的化学成分（或有效成分）与溶剂充分接触，对于溶解性较好的成分，通过超速动态分子渗漉作用使有效成分快速溶解转移，在很短时间内达到内外溶解平衡，一般在十几秒至几分钟即可完成提取，然后过滤即可[5-8]。
本文采用闪式提取法对钩藤药材生物碱成分进行快速提取，并通过均匀设计法对提取工艺优化[9]
，筛选了乙醇体积分数、提取时间、料液比3个影响因素为主要考察因素，以出膏率及生物碱成分含量为评价指标，确定钩藤的闪式提取最佳工艺，以期为钩藤生物碱成分新的提取方法提供研究支持。
1 仪器与试药1.1 仪器
JHBE-50s闪式提取器（河南金鼐科技发展有
限公司），1100型高效液相色谱仪（Agilent公司），DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），AY220电子分析天平（d=0.1 mg，日本岛津），DFT-200手提式高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司），100~1000 μL微量移液器（法国吉尔森公司），5~50、20~200、50~500 μL移液器上海苏阳仪器有限公司）。
1.2 试药
甲醇、乙腈（色谱纯，天津大茂有限责任公司），哇哈哈纯净水，乙醇、冰乙酸、乙酸铵为分析纯；钩藤药材购于沈阳市东北大药房，经辽宁中医药大学张建魁副教授鉴定为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil. 的干燥带钩茎枝。
1.3 对照品
异去氢钩藤碱（isocorynoxeine，ICO），去氢钩藤碱（corynoxeine，COR）前期分离、制备得到，经HPLC检测纯度大于98.0%。
2 方法与结果2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱适量，加甲醇配制浓度为0.0282、0.0691 mg/mL的混合对照品液，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备
取钩藤药材粉末（过40目筛）20 g，置于闪式提取筒内（提取电压120 V），按均匀设计试验方案进行提取，提取液过滤至1000 mL量瓶中，定容，即得。
2.2 测定方法
2.2.1 出膏率测定
精密吸取供试品溶液100 mL，置于已干燥至
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恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥4 h至恒重，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，以干燥品重量除以药材重量计算出膏率（%）。
2.2.2 HPLC测定条件
Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）：0.385%乙酸铵-0.19%冰乙酸水溶液（B），梯度洗脱条件为：0~10 min：15%~27%（A），10~40 min：27%~35%（A），流速1 mL/min；检测波长245 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL，外标法计算二者含量。在上述条件下，供试品色谱中去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱与其他组分分离良好，见图
1。
注：A.对照品，B.样品；1.去氢钩藤碱，2.异去氢钩藤碱。
图1 钩藤提取液HPLC色谱图
2.2.3 HPLC测定方法学试验
线性关系考察：精密称取去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱对照品适量，加甲醇溶解，配制成每1 mL分别含去氢钩藤碱0.0031、0.0306、0.0612、0.0918、0.1224、0.153 mg及异去氢钩藤碱0.002、0.02、0.04、0.06、0.08、0.103 mg的系列对照品溶液。按上述HPLC条件测定，以进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，去氢钩藤碱回归方程为 Y=510396X-66.434，r=0.9995，线性范围0.0031~0.153 mg/mL；异去氢钩藤碱回归方程为Y=58165X-43.12，r=0.9993，线性范围0.002~0.103mg/mL。
精密度实验：取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续测定5次，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱峰RSD
稳定性试验：取同一样品，分别放置0、1、2、4、8 h，按上述HPLC色谱条件进行测定，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱RSD
重复性实验：取同一样品，同法制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱RSD
回收率试验：精密称取已知含量的钩藤药材样品，加入相应的对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制
（
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备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果去氢钩藤碱平均回收率为96.7%，RSD为1.5%；异去氢钩藤碱平均回收率为96.9%，RSD为1.4%。
2.3 均匀设计实验优化闪式提取条件
2.3.1 实验安排及指标确定
考察闪式提取的料液比（X1）、乙醇浓度（X2）、提取时间（X3）3个因素，每个因素设计5个水平，
利用U3
5（5）均匀设计表安排试验。因钩藤生物碱成分在高浓度乙醇溶液中具有较高的溶解度，故设计乙醇浓度范围为30%~90%；为兼顾提取速度和提取效率，提取时间范围设计为40~120 s，料液比为10~50倍，因素水平试验安排见表1。以两种生物碱含量和出膏率为评价指标，优选最佳提取条件。
2.3.2 实验结果
用去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、出膏率三个指标的加权综合评分为考察指标来评价闪式提取的工艺质量。生物碱成分为钩藤药材的活性成分，故其两种生物碱成分含量指标分别赋予权值45；出膏率整体反映提取效果，赋予权值为10，按公式S=A0/Ai*45+B0/Bi*45+C0/Ci*10进行加权处理，计算各提取样品的综合评分值。
以综合评分为指标，以各因素为变量，利用SPSS软件进行二次逐步回归分析，优选R方值接近于1、P值小且选入变量较多的方程，综合得分的回归方程为：Y5=24.92+0.014X1X2+0.279X1-0.092X2，P=0.001，方程有显著意义。确定最佳提取条件液料比为50∶1，醇浓度75%。X3因素（料液比）为非关键因素，表明在40 s内，钩藤药材已基本提取完全，故确定提取时间为40 s。见表1。
表1 均匀实验设计因素水平及结果
水平ABCS
序号液料比乙醇浓度提取时间COR含量ICO含量出膏率综合评分X1（倍）Χ2（%）X3（s）（mg/g）（mg/g）（%）110451000.0460.0149.3930.0022075800.0710.02310.5045.0533030600.0600.02117.1943.4144060400.0830.06115.9864.835
50901200.1000.1508.3894.87
2.4 验证实验
准确称取钩藤药材3份各20 g，按照最佳工艺条件进行平行提取3批，测定其去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的含量及出膏率，结果去氢钩藤碱含量均值为0.14 mg/g，RSD为1.9%；异去氢钩藤碱含量均值为0.31 mg/g，RSD为2.2%；出膏率均值为11.5%，RSD为2.6%。可见，闪式提取法的工艺稳定可行，重现性较好。
3 结论与讨论3.1 闪式提取法
闪式提取法能够破坏根、茎、叶等植物细胞组织，使细胞内部的化学成分（或有效成分）与溶剂充分接触，迅速达到内外溶解平衡。与传统提取方法比较，闪式提取法提取时间短，提取效率高，简便易行，且溶剂用量小，能够节约能源和试剂。特别是其提取过程受温度影响小，常在室温下进行提取，能够避免稳定性较差的某些天然药物成分因受热而被破坏，在需要采用“后下”方式
进行煎煮提取的中药材提取时具有较广泛的应用
前景。从缩短提取时间等角度考虑，闪式提取工艺具有更为明显的优势，所需要时间为常用的煎煮提取、渗滤提取工艺的几十分之一到百分之一。而且，传统提取工艺出膏率较高，加上受药材中淀粉等副产物影响，不同产地的同一药材出膏率重复性差距较大，而闪式提取的出膏率为10%左右，又因提取时间短使得出膏率变化较小，有利于保证药材提取物质量稳定。
3.2 钩藤药材闪式提取研究
钩藤降压、镇静和神经细胞保护等作用的主要药效物质是吲哚、氧化吲哚类生物碱成分，其中钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛与柯诺辛B、去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱、dihydrocorynantheine与毛钩藤碱、去氢毛钩藤碱与缝籽嗪甲醚等多种活性生物碱成分是异构体，而且各种成分在药理作用活性上存在
着较大差别[10]
。例如，异钩藤碱较钩藤碱具有更强的神经保护作用；缝籽嗪甲醚具有更强的血管反应性；dihydrocadambine有强降压和拮抗高血压的作用。若要保证钩藤药材药效作用的一致性，就需要建立一个能够保证主要药效活性成分的含量基本均匀一致、减免活性成分相互转化的高效提取方法，并对各种主要成分的含量范围加以评价，为保证钩藤用药的安全性、有效性及一致性提供物质基本保证。
本研究通过均匀设计闪式提取优化工艺条件，在室温下进行提取，有利于保持钩藤中生物碱类活性成分稳定，避免生物碱成分在高温下发生转化。应用闪式提取器提取时，应将钩藤药材预粉碎，否则药材较大易附着在刀片上，影响提取效率。为了闪式提取器的安全使用，提取电压不宜超过220 V，单次提取时间不宜超过2 min，适宜提取电压为120 V。
研究表明，闪式提取法简便、快速，提取效率高，适合于钩藤生物碱类成分的提取，可作为钩藤药材中生物碱活性成分提取的新方法。◆
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