噬菌体效价的测定

噬菌体效价的测定

一.目的要求

1.学习噬菌体效价测定的基本方法。

2.掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价的基本方法。

二、基本原理:

噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。

三、器材及试剂:

1.大肠杆菌18小时培养液（生物大分子研究室惠赠），

2.大肠杆菌噬菌体10-2稀释液（原液滴度107～1012pfu/ml）（生物大分子研究室惠赠） ；

3.含0.9ml液体培养基的Eppendof管4个

4.肉膏蛋白胨琼脂平板5块（10ml培养基，2%琼脂，作底层平板用）

5.含20ml灭菌琼脂糖培养基锥形瓶一个（0.7%琼脂糖，作顶层培养基用）

6.灭菌小试管5支，灭菌1ml吸管若干，48℃水浴箱等

四、操作步骤：

1．稀释噬菌体

(1) 将4管含0.9ml液体培养基的Eppendof管分别标写10-3，10-4，10-5和10-6。

(2) 用1ml无菌吸管吸0.1ml 10-2大肠杆菌噬菌体，注入10-3的试管中，旋摇混匀。

(3) 用另一支无菌吸管从10-3管中吸0.1ml加入10-4管中，混匀，余类推，稀释至10-6管。

2．噬菌体与菌液混合

(1)将5支灭菌空试管分别标写10-4，10-5，10-6，10-7和对照。

(2)用吸管从10-3噬菌体稀释管吸0.1ml加入10-4的空试管内，用另一支吸管从10-4稀释管内吸0.1ml加入10-5空试管内，直至10-7管。

(3)将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液0.9ml加入对照试管内，再吸0.9ml加入10-7试管，如此从最后一管加起，直至10-4管，各管均加0.9ml大肠杆菌培养液。

(4)将以上试管旋摇混匀。

3．顶层培养基加入混合液内

(1)将顶层培养基熔化，冷却至～50℃，并放入50℃水浴箱内保温。

(2)分别向4管混合液和对照管对号加入3ml顶层培养基。每一管加入顶层培养基后，立即振摇混匀。

4．接种了的顶层培养基倒入底层平板上

(1)将旋摇均匀的顶层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上轻摆摇匀，使顶层培养基铺满平板（如不能铺满，培养基凝固后不要继续摇动）。

(2)凝固后，倒置37℃培养。记录培养时间

5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30～300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。

噬菌体效价=噬菌斑数×稀释倍数×10

五、实验报告:

1．结果

(1)记录平板中每一稀释度的噬

菌斑数于下表中。并记录培养时间

(2)噬菌体效价是多少？

六.思考题：

（1）什么因素决定噬菌斑的大小？

（2）测定噬菌体效价，操作时要注意些什么才能测定准确？

（3）噬菌体与菌液混合后保温时间越长其吸附率越高的说法对吗？

（4）为什么选用双层琼脂平板法测定噬菌体效价？

七.实验关键问题，注意事项及实验要求

1.关键问题：稀释，温度，倒板

2.注意事项：移液器使用及登记，

3.实验要求

4.预习报告（写清具体实验步骤），试管清洗，Tip回收，实验室卫生，保持安静，结果观察请于实验后第二日观察。

5.实验报告要求（清晰简洁，记录关键内容）

6.实验过程，实验报告及实验考核综合评定此次实验成绩。

八.物品准备

1.ER2738菌液：每组～10ml（注意保持无噬菌体污染）

2.M13KE：每组一只（1ml）

3.稀释用培养基：无菌水替代（TBS）

4.实验操作无需在超净台进行（原因，另外是否所有测定滴度的实验都可以）

5.EP管，Tip头用量

6.培养皿（实验台面），固体培养基（培养箱），顶层培养基（培养箱内）（感谢）