DEAE-Dextran细胞转染试剂盒

DEAE-Dextran细胞转染试剂盒

简介：

外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖(Dextran)

转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。DEAE-葡聚糖转染法的原理是带正电荷的DEAE-葡聚糖与带负电的核酸的磷酸骨架相互作用，形成复合物，该复合物通过细胞内吞噬作用使DNA转导进入细胞核。Leagene DEAE-Dextran细胞转染试剂盒(DEAE-Dextran Cell Transfection Kit)适用于瞬时转染(transient tranfection)，不宜用于筛选稳定表达细胞株，这是因为DEAE-dextran在较高浓度作用较长时间会对细胞产生一定毒性。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

(一)常规转染：

1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，

待细胞密度大50～70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。

2、 弃培养液，用PBS清洗细胞2次，再用TBS-D buffer清洗1次，吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板，按照下表依次加入DEAE-Dextran， DNA以及适量的

TBS-D，使其总体积为170μl，即为DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液，用移液器

备注：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，

因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿，试剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。

4、 转染：把170μl转染液滴加到细胞表面，轻轻晃动6孔板，使其与细胞表面充分接触

37℃孵育，观察细胞至皱缩变圆为止。

5、 参考上表，每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DEAE-Dextran-DNA-TBS-D转染液体

积的10倍)。

6、 可选步骤：参考上表，每孔加入Chloroquine solution，亦可和上一步骤中1.7ml细

胞培养液预先混合后一起加入。

7、 培养不超过2h或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜培养液继续培养，通常转染后

48～72小时可以检测转染效果。 (二)预处理转染：

1、 在转染前24h用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，

待细胞密度大50～70%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。

2、 弃培养液，用PBS清洗细胞2次，再用TBS-D buffer清洗1次，吸尽残液。 3、 配制转染液: 对于6孔板，按照下表依次加入DEAE-DextranPBS，使其总体积为1ml，

即为DEAE-Dextran工作液。

4、 预转染：对于6孔板，把1ml转染液滴加到细胞表面，轻轻晃动6孔板，使其与细胞

表面充分接触，37℃孵育10min。

5、 洗涤：弃液，用TBS-D buffer轻轻清洗1次，PBS轻轻清洗1次，注意防止细胞脱落。 6、 弃洗涤液，参考下表，每孔缓慢均匀加入162μDNA工作液。

7、 37℃孵育30min，参考下表，每孔缓慢加入1.7ml细胞培养液(约DNA工作液体积的

10倍)。

备注：对于六孔板中一个孔的细胞，DNA可以在1～3μg的范围内进行适当调节。最佳的转染条件，因具体的细胞和培养条件而定，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。对于其它培养板或培养器皿，试

剂的用量可大致按照细胞培养面积按比例换算。

8、 可选步骤：参考上表，每孔加入17μl Chloroquine solution，亦可和上一步骤中1.7ml

细胞培养液预先混合后一起加入。

9、 培养不超过4h或在出现明显的细胞毒性前，更换新鲜培养液继续培养，通常转染后

48～72小时可以检测转染效果。

注意事项：

1、 注意无菌操作，尽量避免污染，同时DNA不应含有蛋白和酚。

2、 休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。 3、 转染12～24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。 4、 如果转染效率低下，有可能是过多细胞死亡所致，应考虑减少DEAE-Dextran的用量或作用时间，或者减少氯喹作用时间。 5、 支原体污染细胞，易导致转染不稳定。