第38卷 第2期2010年2月西北农林科技大学学报(自然科学版)
Jo ur nal of N o rthwest A &F U niver sity(N at. Sci. Ed. )
Vo l. 38N o. 2Feb. 2010
中药免疫调节剂对免疫抑制模型小鼠的保护作用
韩春杨, 刘翠艳
(安徽农业大学动物科技学院, 安徽合肥230036)
*
[摘 要] 目的 研究中药免疫调节剂对免疫抑制小鼠的组织保护作用。 方法 用环磷酰胺(Cy clophospha mide, Cy ) 构建小鼠免疫抑制病理模型。分别给正常小鼠和环磷酰胺所致免疫抑制小鼠饮服自制中药免疫调节剂玉屏风散加减(ZY ) 和经典方剂玉屏风散(Y PF ) , 检测ZY 、Y PF 对不同免疫状态下小鼠血液学指标(白细胞计数(WBC) 、红细胞计数(RBC) 、血红蛋白(HG B) 、红细胞压积(HCT ) 、平均血红蛋白含量(M CH ) 、平均红细胞体积(M CV) ) 、体质量、脾脏指数以及肝脾组织病理学的影响。 结果 (1) ZY 和YP F 对健康小鼠血液学指标影响不显著(P >0. 05) ; ZY 对Cy 所致的免疫抑制小鼠WBC 、RBC 、H GB 、H CT 、M CH 、M CV 值有显著影响(P 0. 05) , 而对Cy 所致的免疫抑制小鼠体质量影响显著(P
[关键词] 中药免疫调节剂; 环磷酰胺; 免疫抑制; 玉屏风散加减[中图分类号] S853. 74
[文献标识码] A
[文章编号] 1671 9387(2010) 02 0047 05
Protective effect of Chinese herbal medicine imm unomodulator on
tissues of im munosuppressed mice by cyclophosphamide
H AN Chun yang, LIU Cui yan
(Colleg e of A nimal Sc ienc e and Te chnology , A nhui A gr ic ultur e Univ esity , H e f ei, A nhui 230036, China)
Abstract: Objective T he study w as to ex plo re the protective effect o f Chinese herbal medicine im mu nom odulator o n the tissues of immuno suppressed mice. M ethod T he imm unosuppressed m ice were in duced by cy clo phosphamide (Cy ). The normal mice and immunosuppressive mice w ere administered sepa r ately w ith the Chinese herbal im muno modulator (ZY) and tr aditional pr escriptio n Yupingfeng (YPF) , and then their hematolog ical parameters(WBC, RBC, H GB, H CT, MCH and MCV) , body w eig ht, spleen index and histopatholog ical changes o f liver and spleen in different imm une status w ere detected. Result (1) H em ato logical parameter s of healthy mice w ere not significantly affected by ZY and YPF (P >0. 05) ; The hematolo gical parameters(WBC, RBC, H GB, H CT , M CH and M CV ) o f im munesuppressive mice induced by Cy w ere sig nificantly affected by ZY(P 0. 05) ; But the immunosuppressed mice induced by Cy w ere sig nificantly affected (P
*
[收稿日期][基金项目][作者简介][]
2009 07 01
安徽高校省级自然科学研究重点项目(KJ2009A033Z) ; 山东省中青年科学家科研奖励基金项目(2008BS07001) 韩春杨(1972-) , 男, 河北冀州人, 讲师, 博士, 主要从事临床兽医学研究。E mail:lu ckyhcy@163. com ) 女, , , @com
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西北农林科技大学学报(自然科学版) 第38卷
show ed that the splenic w hite pulp of mice in hispatho logic slide w as large and obv ious and liver cells had mild degener ation and necro sis in gro up ZY+Cy and gro up YPF+Cy; splenic w hite pulp w as not obv io us and liver cells had a severe deg ener ation and necrosis in gro up Cy. Co nclusion ZY had r em arkable effects on the hematolo gical parameters, body w eight and o rgan index of nor mal m ice. H ow ever, it had significant positiv e effects on hematolo gical par am eters, body w eig ht, org an index and patho logy in the liver and spleen tissue of imm unosuppr essive m ice.
Key words:Chinese herb im munom odulator; cyclopho spham ide; immune suppression; traditional pre scriptio n Yuping feng
近年来, 人和动物免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病的发病率逐年上升, 工业环境污染、生态失衡引发的多因子、多属性、多层次的代谢性疾病、慢性疾病也日渐增多。在这些疾病治疗过程中, 西药作用单一, 毒副作用明显, 且对于免疫抑制性疾病、病毒感染性疾病及多因子多层次的慢性病没有特异疗效[4 7]。而中药在组成上具有天然合理性, 中药配伍讲究君臣佐使、协调配合, 具有标本兼治、毒副作用小等特点。自制中药免疫调节剂玉屏风散加减(ZY) 是本课题组筛选出的具有免疫增强作用的中药复方。前期研究结果表明, ZY 无急慢性毒性[8], 能显著提高环磷酰胺(Cyclophosphamide, Cy) 所致免疫抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫功能[9]。为进一步探讨玉屏风散加减对免疫功能的调节作用, 本试验以扶正固本的经典方剂玉屏风散(YPF) 为对照药物, 观察了ZY 对不同免疫状态(正常和免疫抑制) 小鼠血液学指标、体质量及脏器指数、肝脾组织病理学的影响, 以期为ZY 的临床应用奠定基础。
[1 3]
1. 1. 3 仪 器 H ANGPING JA1003型电子天平, 上海精科称量仪器厂生产; F 820型全自动血液
分析仪, 日本希森美康生产; Leica 石蜡切片机, 德国Leica Micr osy stems Nussloch Gm bH 。
1. 2 方 法
1. 2. 1 动物的分组与处理 90只小鼠于购回后第2天空腹称体质量, 随机分为6组, 每组15只。第1组为正常对照组, 不给中药, 不注射Cy; 第2组为ZY 组, 给予ZY, 不注射Cy; 第3组为YPF 组, 给予YPF, 不注射Cy ; 第4组为Cy 对照组(Cy 组) , 注射Cy ; 第5组为ZY 治疗组(ZY +Cy) , 注射Cy , 并给予ZY 治疗; 第6组为YPF 治疗组(YPF+Cy) , 注射Cy, 并给予YPF 治疗。第2, 3, 5, 6组小鼠灌胃给药1. 8m L/只, 第1, 4组给予等量蒸馏水, 连续11d 。从试验的第3天起, 4, 5, 6组小鼠开始以75mg/kg 的剂量腹腔注射Cy, 隔日一次, 连续注射4次, 期间按正常剂量饮水(第4组) 或饮药(第5, 6组) 至停止注射Cy 的第2天。
1. 2. 2 样品的采集与检测 各组均于试验的第11天(即第4, 5, 6组停止注射Cy 2d 后) 断尾采血, 肝素抗凝, 检测血常规(白细胞计数(WBC) 、红细胞计数(RBC) 、血红蛋白(H GB) 、红细胞压积(H CT) 、平均血红蛋白含量(MCH ) 、平均红细胞体积(MCV) ) 。采血后称体质量。所有小鼠采血后继续常规饲养1周(均供给正常的饲料和饮水, 不使用任何药物处理) , 至试验的第18天时(即试验结束) 处死, 取脾脏和肝脏, 观察病理变化, 计算脾脏指数; 然后将肝和脾用体积分数10%甲醛固定, 脱水, 石蜡包埋, 常规方法制备切片并H E 染色, 光镜下进行组织病理学检查。
1. 2. 3 数据处理 所有试验数据采用SPSS10. 0软件进行One w ay A NOVA 统计处理, Duncan 氏比较差异显著性, 所有数据用 平均值 标准差(X SD ) 表示, P
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 试验动物 6周龄昆明种小鼠90只, 体质量18~20g , 雌性, 购自山东米歇尔生物制品有限公
司动物饲养中心, 实验动物生产许可证号:20030011。
1. 1. 2 药 物 Cy, 上海华联制药有限公司, 批号:080705。ZY:黄芪60g 、白术30g 、茯苓30g 、桔梗15g 、党参30g 、防风15g 。YPF:黄芪90g 、白术60g 、防风30g, 选自 中国兽药典 。所用中药饮片均购自山东泰安金泰联医药商行。
中药药液的制备采用传统水煎法:蒸馏水预先浸泡1h, 加热煎煮2次, 第1次保持微沸30m in, 滤出药液; 药渣加温水再煮沸, 仍保持微沸30min, 滤出药液。合并2次滤液, 小火浓缩至生药含量为1g/
第2期韩春杨, 等:中药免疫调节剂对免疫抑制模型小鼠的保护作用
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2 结果与分析
2. 1 Cy 对小鼠精神状态的影响
给第4, 5, 6组小鼠腹腔注射中等剂量的Cy (75mg/kg ) 2~3次后, 小鼠即表现出精神沉郁、怕冷、扎堆现象, 饮食欲明显减退, 生长发育受到抑制, 几天后体质量显著减轻; 但只要停注Cy, 2~3d 后小
鼠的精神会很快好转, 饮食欲也随之逐渐恢复, 体质量逐渐增加(与注药期间相比) 。第1, 2, 3组小鼠在整个试验期内未见明显的精神异常。
2. 2 中药方剂ZY 、YPF 对小鼠血液学指标的影响各组均于试验的第11天断尾采血, 肝素抗凝, 检测血常规, 结果见表1。
表1 Z Y 和YP F 对试验小鼠血液学指标的影响(n =10)
T able 1 Effect o f Chinese herbal medicine immuno po tentiator on hemato lo gical index es of the experimental mice (n =10)
组别Group 123456
W BC/(109 L -1) 12. 44 1. 02c 13. 30 1. 60c 13. 60 0. 82c 4. 21 0. 44a 5. 74 0. 55b 5. 22 0. 54a
RBC/(1012 L -1) 11. 26 0. 57c 10. 87 0. 94c 12. 08 0. 59c 8. 83 0. 41a 9. 55 0. 42b 9. 46 0. 33b
HGB/(g L -1) 176. 20 3. 56c 175. 20 5. 02c 181. 20 3. 63d 141. 80 2. 38a 159. 20 1. 92b 152. 20 2. 49b
HCT /%53. 46 1. 81c 52. 40 3. 35c 55. 26 2. 49c 42. 72 1. 64a 49. 38 2. 77b 43. 86 4. 76a
M C H/pg 15. 60 0. 59a 16. 10 0. 79b 14. 98 0. 53a 15. 58 0. 18a 16. 80 0. 54b 16. 34 0. 56b
M CV/fL 47. 64 1. 40a 47. 68 1. 00a 46. 76 0. 48a 47. 02 1. 67a 53. 82 3. 29b 47. 68 1. 02a
注:同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P
Note:Differen t sm all letters in the same column mean significant differ ence(P
从表1可以看出, 1, 2和3组小鼠WBC 、RBC 、H CT 、M CV 值差异均不显著(P >0. 05) , 3组H GB 值显著高于1, 2组, M CH 值2组显著高于1, 3组(P 0. 05) ; 5组小鼠的M CH 和M CV 值与1组相比差异显著(P 0. 05) ; 5, 6组小鼠WBC 、RBC 、H GB 、H CT 、M CH 、M CV 值较4组均有不同程度的提高, 5组所有指标与4组相比差异显著(P
6组小鼠WBC 、RBC 、H GB 和H CT 值均未能达到
正常水平(与1组相比, P
2. 3 中药方剂ZY 、YPF 对小鼠体质量及脾脏指数
的影响
由表2可知, ZY 及YPF 分别对第2和3组小鼠的生长有一定的促进作用, 小鼠试验末体质量与1组相比差异显著(P 0. 05) ; 注射Cy 的4, 5, 6组小鼠试验末体质量明显下降, 第4组呈负增长, 而5和6组平均增重率分别为3. 37%和1. 08%, 说明中药治疗组小鼠能在一定程度上拮抗Cy 造成体质量下降的不良影响。脾脏指数1, 2, 3组之间差异不显著(P >0. 05) ; 4, 5, 6组与1, 2, 3组均差异显著(P
表2 ZY 和Y PF 对试验小鼠体质量和脾脏指数的影响(n =10)
T able 2 Effect of Chinese herbal medicine immuno po tent iator on weight and o rg an index o f the ex perimental mice (n =10)
组别Group 123456
试验初体质量/(g 只-1)
Initinal w eight
20. 35 0. 96a 20. 84 0. 84a 21. 27 1. 07a 20. 85 0. 85a 20. 17 0. 47a 20. 30 0. 62a
试验末体质量/(g 只-1)
Final w eig ht
25. 90 0. 79c 26. 89 0. 92d 26. 51 0. 66d 19. 81 0. 77a 20. 85 0. 94b 20. 52 1. 21b
增重率/%GW R 27. 0029. 1029. 00-4. 993. 371. 08
脾脏指数
S pleen/w eig ht ratio 8. 00 0. 81a 8. 20 0. 51a 8. 50 1. 03a 12. 80 0. 09d 9. 15 0. 04b 9. 81 0. 08c
2. 4 中药方剂ZY 、YPF 对小鼠肝脾组织病理学变
化的影响2. 4. 1 眼观变化 注射Cy 的小鼠, 脾脏均出现不同程度的肿胀, 含血量增加, 同时肝脏出现水肿, Cy
组尤为明显; 注射Cy 并饮服中药的5和6组小鼠仍有程度不同的肝脾肿胀现象, 但肿胀程度较Cy 组减轻; 其他脏器未见明显肉眼病变。没有注射Cy 的各组小鼠(1~3组) 肝脾等脏器未见明显变化。
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西北农林科技大学学报(自然科学版) 第38卷
2. 4. 2 组织病理学变化 对肝和脾进行组织病理学检查发现, Cy 组小鼠脾脏组织中的白髓不明显(图1 A) , 红髓脾索变宽, 脾窦不规则, 淋巴细胞严重缺失, 可见局灶性坏死、出血、纤维组织增生; 肝细胞板不明显, 胞质呈空泡状, 核固缩或消失, 变性、坏死明显(图1 B) 。ZY+Cy 和YPF+Cy 组小鼠肝细
胞板完整, 排列规则, 细胞核大而深染, 胞质染色均匀, 肝组织未见明显病变, 个别小鼠肝细胞轻度变性坏死(图1 C, D) ; 脾组织中的白髓大而明显(图1 E, F) , 淋巴细胞密集, 排列有规律, 红髓的脾索变窄, 淋巴细胞密集, 脾窦规则。ZY +Cy 组肝脾损伤程度较YPF+Cy
组轻。
图1 各组小鼠脾脏和肝脏的病理变化(H E 染色, 200)
A. Cy 模型组脾脏; B. Cy 模型组肝脏; C. ZY+C y 组肝脏; D. YPF+Cy 组肝脏; E. ZY+Cy 组脾脏; F. YPF+Cy 组脾脏
Fig. 1 Pat ho lo gical section of spleen and liv er (HE, 200)
A. T he s plen ic wh ite pulp of group Cy; B. Th e liver of group Cy; C. T he liver of gr ou p ZY+Cy; D. T he liver of g rou p YPF+Cy;
E. T he s plen ic w hite pulp of group ZY+Cy; F. T he splenic w hite pu lp of group YPF+Cy
综合上述试验结果, 分析得出以下结论:(1) ZY 、YPF 对正常小鼠血液学指标(WBC 、RBC 、H GB 、HCT 、M CH 、MCV) 及脾脏指数没有显著影响, 而对Cy 所致的免疫抑制小鼠的血液学指标及脾脏指数有一定程度的促恢复作用, 其中ZY 作用效果优于YPF, 但WBC 、RBC 、H GB 和H CT 值未能达到正常水平。(2) ZY 及YPF 能在一定程度上拮抗Cy 造成的小鼠体质量下降、脾脏增生等毒副作用, ZY 作用效果优于YPF 。(3) 组织病理学观察发现, ZY 及YPF 能有效拮抗Cy 对肝脾组织造成的损伤作用, 其中ZY 作用效果优于YPF 。
明显, 而Cy 所致的免疫抑制小鼠饮服中药后其血液学指标及脾脏指数变化较明显。这说明该中药免疫调节剂具有双向免疫调节作用。
中兽医学认为, 脾为 后天之本 , 为机体气血生化之源, 肝藏血主疏泄, 二者均是水谷消化吸收的主要器官。病理损伤必然会造成水谷得不到充分的消化吸收和运输, 血液化生没有来源, 出现精神短少、贫血, 影响发育。本试验所用ZY 复方即是基于中医学的这一理论, 从维护巩固机体正气的角度进行遣方用药。方中黄芪、白术、党参均为补脾益气常用药; 茯苓归心脾肾经, 也能益脾和胃; 桔梗入肺胃经, 能调节肺胃, 宣肺利咽喉; 防风入肝脾膀胱经。本方剂重在补脾益气, 同时还能利湿化痰。现代药理学研究表明, 黄芪、白术、防风、茯苓、党参、桔梗均含有丰富的多糖成分, 另外还含有黄酮、皂甙类等活性成分[11 16], 它们对动物免疫功能均具有不同程度的促, , [10]
3 讨 论
中药免疫调节剂玉屏风加减, 应用于正常小鼠
和免疫抑制小鼠后产生了不同的作用效果, 即生理机能正常的小鼠饮服ZY 后其血液学指标(WBC 、
第2期韩春杨, 等:中药免疫调节剂对免疫抑制模型小鼠的保护作用
51
的数量, 增强免疫细胞的活力, 针对性地保护免疫器官, 从而改善机体状况, 增加抗感染能力。组成玉屏风散加减的各味中药相辅相成, 共同发挥增强机体免疫机能的作用。ZY 对Cy 小鼠肝、脾组织形态学变化的影响进一步佐证了其对机体免疫器官损伤具有较好的保护作用。[参考文献]
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