[摘要] 艾滋病（AIDS）患者常用唐草片进行辅助甚至替代治疗，然而中药成分复杂，其对抗病毒药物的影响及其作用机制尚不清楚。CYP450酶是药物的主要代谢酶，因此，研究中药唐草片与依非韦伦联合用药前后对CYP450酶的调控具有重要意义。蛋白质组学以其高通量高灵敏度的特点被广泛用于代谢酶的研究。 该文采用差速离心法分离肝微粒体，SDS-PAGE分离其蛋白质，切取CYP450所在的3条电泳带，用液相色谱串联质谱进行鉴定，一共鉴定了16个CYP450同工酶。为了定量分析唐草片对CYP450酶的影响，采用基于质谱的多反应监测技术（MRM）。根据蛋白质的质谱鉴定结果，选择CYP2C11。其特征多肽通过Expasy blast搜索获得。片断离子的m/z
[关键词] 唐草片；蛋白质组；CYP450；依非韦伦
[收稿日期] 2014-01-10
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09303013）；国家自然科学基金面上项目（81271834）
[通信作者] 张丽军，Tel： （021）57036557， E-mail： zhanglijun1221@163.com；程能能， E-mail： nncheng@gmail.com
细胞色素CYP450是一个多功能氧化酶的超家族，为临床70%～80%药物的第一相代谢酶[1]，在药物作用下CYP450酶也发生表达和功能调控等变化[2]。近年来研究发现很多中草药如人参和藜芦等都对CYP450酶有调控作用[3-4]。唐草片是唯一一个被国家食品药品监督管理局（CFDA）批准用于HIV感染者的辅助用药，正被越来越多的患者所使用。但是唐草片成分复杂，其对抗病毒药物的影响令人担忧。因此，研究唐草片和抗病毒药物（如依非韦伦）联合用药时对CYP450蛋白质表达的影响具有重要意义。
研究CYP450酶的方法常为免疫酶联、酶活测定以及PCR等，但是这些方法难以批量研究CYP450酶。近年发展的蛋白质组学方法以其高通量、高灵敏度等特点在CYP450酶研究中得以应用[5]。本研究采用SDS-PAGE分离微粒体蛋白质、切取CYP450酶对应分子量的条带、通过液相色谱串联质谱进行鉴定，采用多反应监测（MRM）方法对鉴定的CYP2C11进行定量分析。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 依非韦伦片剂（规格600 mg/片， 批号S2520） 由Merck公司生产，唐草片（规格400 mg/片，批号090301）由上海百岁行药业有限公司生产。蛋白质组试剂购自通用电气公司[The General Electric （GE） Company （Fort Myers， Florida， USA）]， 乙腈、甲醇和甲酸均为Merck公司（Whitehouse Station， NJ， USA）的色谱纯试剂。其他分析试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 动物处理 10只雄性SD大鼠180～200 g，购自上海市公共卫生临床中心动物中心。所有的大鼠实验通过单位伦理审核且获得上海市公共卫生临床中心的伦理批文，饲养在温度控制的房间里，且保证12 h白天与黑夜交替。所有大鼠自由进食，随机分为2组，每组5只包括单独服用EFV组（命名为EFV）， 同时服用EFV和唐草片（命名为EFV-0T）。EFV和唐草片的用药剂量分别为54，864 mg・kg-1。实验前大鼠被禁食过夜（12 h），单次用药，给药1 h后正常喂水和食物，12 h后使大鼠安乐死，肝脏用于微粒体分离。
1.3 微粒体分离 按照文献报道的方法[5-6]稍作修改后进行微粒体的分离，大鼠安乐死后，剪碎肝组织，用生理盐水反复冲洗去除血液，同时去除结缔组织。然后加入2倍体积的匀浆缓冲液（100 mmol・L-1 Tris-HCl （pH 7.4， 4 ℃）， 0.15 mol・L-1蔗糖， 25 mmol・L-1 KCl， 5 mmol・L-1 MgCl2和20 mmol・L-1蛋白酶抑制剂，用Ultra Turrax T8 （Janke and Kunkel， IKA Labortecnik， Staufen， Germany） 匀浆器匀浆。匀浆液经 2 400 ×g离心10 min去除未破碎的细胞、细胞核和细胞碎片，收集上清；15 000×g，4 ℃离心10 min，收集上清；100 000×g，4 ℃离心60 min，沉淀即为微粒体；用PBS洗涤2次，12 000×g，4 ℃离心 20 min收集沉淀。沉淀储存在-80 ℃冰箱内以便后续实验使用。
1.4 CYP450酶的鉴定 从以上分离的微粒体中提取蛋白质，每只大鼠100 μg微粒体蛋白质用SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝G250染色。按照文献报道的方法[5-6]切取相对分子质量为45， 62 kDa的条带，用胰酶（40 mg・L-1）消化，然后用纳升液相色谱（戴安Ultra 3000，日本）串联质谱（Bruker HCT离子肼质谱，德国）进行鉴定[7]。 1.5 MRM定量CYP450酶 CYP2C11被选做MRM定量，采用HPLC（SHIMADZU HPLC， 日本）串联质谱（Applied Biosystems API3200，美国）进行定量分析[8-10]。合成内标肽（IS） ELNNALQNLARTI （ESAT-6）（该多肽来自结核分泌抗原6 kDa的64～76位氨基酸序列）。用100 μL 2% ACN 和 0.1%甲酸从第2条带提取CYP2C11多肽，且加入10 μL 的 1 mg・L-1内标 （IS），吸取45 μL样品用于质谱分析。Acclaim PepMap C18色谱柱（150 mm×1.0 mm， 5 μm） ，流速为0.06 mL・min-1。色谱梯度为0～12 min，4%～45% ACN（含0.1%甲酸）；12～20 min，45% ACN （含0.1%甲酸）；20～25 min，80% ACN （含0.1%甲酸）和25～50 min，4% ACN（含0.1%甲酸）。 质谱参数为MRM模式，离子源电压5 500 V；CAD 60；DP 50；EP 8 和CE 35。CYP2C11的特征肽通过Expasy blast搜索获得。MRM定量的离子对选自HCT离子肼质谱鉴定的结果，且片断离子的m/z 2 结果
2.1 CYP450酶鉴定 通过差速离心的方法从大鼠肝脏中分离微粒体，用SDS-PAGE分离，见图1。EFV单独处理和EFV与唐草片联合用药组的电泳条带基本一致。切下相对分子质量从42～62 kDa的3条蛋白质带用于质谱鉴定，一共鉴定了16个CYP450同工酶，见表1，包括CYP2B，CYP2C和CYP3A等。人工检查匹配的肽段确证各蛋白质都被准确鉴定。
2.2 CYP2C11定量分析 用于MRM定量的CYP2C11的多肽需满足以下条件： 多肽的mascot 搜索得分超过39；在序列中没有C，M或者NG氨基酸，没有N端的Q或者E；没有胰蛋白酶漏切的位点，也就是说在序列中部没有R或者K；没有已知的糖基化位点；在C-端没有脯氨酸（Pro）如P1和P2；多肽的长度为1～25个氨基酸；通过NCBI 或者Expasy blast搜索确定用于定量的蛋白质特征肽。CYP2C11的1条m/z为711.5的多肽满足以上条件。随后采用三重四极杆质谱API3200扫描母子离子对，扫描到四对能用于准确定量的离子对，见图2。通过比较相对峰面积发现CYP2C11在EFV与唐草片同时服药组中上调了1.6倍（P 3 讨论
大鼠肝脏微粒体酶参与内源物质（类固醇等） 和外源化合物（药物、食品添加剂和环境污染物等） 等的代谢过程，同时其活性易受某些化学药物的诱导作用，从而影响大鼠的代谢，因此开发全面研究CYPP450 酶的方法具有重要的意义。本研究有效富集了肝脏微粒体，采用基于SDS-PAGE的蛋白质组学方法鉴定了16个CYP450酶。该方法比常用的免疫酶联法以及PCR等方法具有更高的通量。
中药成分非常复杂，对CYP450 酶的作用是一种客观存在[4]，本研究发现与EFV单独服药组相比，唐草片与EFV联合用药上调CYP2C11的表达。本研究首次利用蛋白质组学方法研究唐草片对CYP450代谢酶的影响，且利用现代质谱技术准确定量了CYP2C11的表达变化。但是唐草片对CYP2C11调控的作用机制以及其对其他CYP450代谢酶的影响有待深入研究。
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Proteomic study on effect of Tangcao pill on microsome CYP450
ZHANG Li-jun ， JIA Xiao-fang ， YIN Lin， LIU Xiao-qian， SHEN Yin-zhong， LU Hong-zhou， CHENG Neng-neng
（1. College of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 200032， China；
2. Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）
[Abstract] Tangcao pill is commonly applied in adjuvant and even alternative therapy for patients with AIDS. However， the herb contains complex ingredients， but with unknown effect against anti-HIV drug and unknown function. Because CYP450 emzyme is the main metabolic enzymes of the drug， it is of important significance to study the regulation of CYP450 enzymes before and after the combined administration of Tangcao pill and EFV. Proteomics， due to its high throughout and high sensitivity， has been widely applied in CYP450 enzyme study. In this paper， liver microsomes were separated through differential centrifugation. Their proteins were separated through SDS-PAGE. The three protein bands that CYP450 enzymes were located were cut and identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Totally 16 CYP450 isoenzymes were identified. Furthermore， in order to make a quantitative analysis on the effect of tang herb on CYP450 emzyme， the multiple reaction monitoring （MRM） technology based on MS was adopted. The CYP2C11 was selected based on the results of the mass spectrum identification of proteins. The characteristic polypeptides were obtained through searching Expasy blast database. The m/z of the fragment ions was less than 800. In the paper， the m/z of ion pairs of CYP2C11 were 711.5/232.1， 711.5/319.2， 711.5/466.2 and 711.5/595.3， and the m/z of ESAT-6（internal standard，IS） were 735.5/215.3， 735.5/389.3， 735.5/460.3 and 735.5/524.3. The relative peak （analyte/IS） area was adopted for the relative quantitative analysis. Compared with the EFV single administration group， the EFV and Tangcao pill combined administration group showed a 1.6-fold increase in CYP2C11. The results of the paper indicated that Tangcao pill may affect drug metabolism by regulating metabolic enzymes such as CYP2C11， but the specific mechanism still unknown.
[Key words] Tangcao pill； proteomics； CYP450； EFV
doi：10.4268/cjcmm20141138
[责任编辑 陈玲]