慢性血栓栓塞性肺动脉高压的病理生理机制研究及心肺运动试验的预测作用
一、研究背景慢性血栓栓塞性肺动脉高压(Chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH)在肺动脉高压分类中属于第四大类。急性肺血栓栓塞症
(Acute pulmonary thromboembolism, APE)患者5年内发生CTEPH 的累积发病率约为0.4%-5.1%。这一部分患者发生CTEPH 的病理生理机制目前不明确。CTEPH 的病理特征为肺动脉内不能消融的血栓继发纤维化、机化。既往有多项研究显示：
1、铁代谢紊乱与血栓性疾病密切相关。2、病理研究显示CTEPH 患者的非阻塞血管的远端动脉也发生了与特发性肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH) 相同的丛状病变。基因突变是特发性PAH 及可遗传性PAH 的重要发病机制, 目前已发现多个基因突变与PAH 发病有关,CTEPH 患者是否存在PAH 相关的基因突变目前尚不清楚。3、差异蛋白质组学研究是明确疾病发病机制、寻找疾病特异的蛋白质分子的良好方法。4、及早发现CTEPH 的存在并给予积极治疗有望改善患者预后。因此本课题从铁代谢、基因突变和蛋白质组学三个方面探讨CTEPH 可能的发病机制；并以心肺运动试验评估APE 后不同疾病状态患者的表现, 以寻找预测CTEPH 的敏感因子。二、研究内容第一部分铁代谢在CTEPH 发病过程中作用的研究1、研究目的通过比较CTEPH 患者和急性PE 事件后痊愈的患者铁代谢情况, 明确铁代谢是否与CTEPH 有关。2、研究方法2.1研究对象：2013年4月至2014年3月在阜外医院肺血管病科住院的明确诊断的CTEPH 患者和慢性PE 患者。2.2实验室检测：收集空腹血浆, 检测血浆自由铁浓度、铁蛋白、可溶性转铁蛋白受体(sTfR)、hepcidin-25、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-6(IL-6)、丙二醛(MDA)水平。2.3统计学分析：连续数据两组间比较采用student’s t检验或Mann-Whitney U检验；分类变量的两组间比较采用卡方检验。非结合铁离子浓度与hepcidin-25、 sTfR, 铁蛋白、sTfR/铁蛋白比值、TNF-α,IL-6、MDA 间的相关关系采用Spearman 相关系数表示。hepcidin-25浓度与上述各检测指标的关系采用Spearman 相关系数表示。Logistic 回归模型分析CTEPH 与上述各检测指标的关系。3、研究结果血浆非结合铁离子浓度在CTEPH 组与慢性PE 对照组无明显差别。两组间hepcidin-25、sTfR 、TNF-α、MDA 水平也无显著差别。CTEPH 组的IL-6显著高于对照组。hepcidin-25水平与sTfR 浓度呈负相关(Spearman’s r=-0.438, p
无PAH 的患者。CBLN2的CDS1因技术原因PCR 扩增失败。共发现40个基因突变位点, 包括31个点突变和9个片段重排。13个位点很可能造成功能破坏,2个突变位点可能造成破坏,2个突变位点为良性突变。3名研究对象有多处的点突变。CTEPH 患者的PAH 相关基因的非同义突变比率大于对照组(CTEPH组25/49(51%)vs.对照组3/17(18%),p=0.022)。共发现12个在dbSNP 数据库中已有记录的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。比较了两组间的基因型及等位基因频率后, 发现SNP rs3739817和SNP rs55805125与CTEPH 有关。4、第二部分研究结论中国汉族CTEPH 患者中较高的PAH 致病基因的突变频率可能与CTEPH 发病有关。第三部分CTEPH 患者的蛋白质组学研究1、研究目的从CTEPH 患者的肺动脉内膜切除组织中进行差异蛋白质对比, 以寻求发病过程中的“特异蛋白质分子”或“特异的信号转导通路”。2、研究方法2.1实验分组：1)CTEPH 患者行肺动脉血栓内膜切除术中取得的增生内膜组织提取蛋白质的等份混合物；2) 培养的人肺动脉内皮细胞、人肺动脉平滑肌细胞、人肺成纤维细胞, 收集并鉴定后提取蛋白质的等份混合物。2.2两组蛋白质混合物以高效液相色谱(high-performance liquid chromatography, HPLC)分离后作色质联用进一步分离、鉴定。2.3两次均分离鉴定到的蛋白质在两组间比较, 取得病变组织特异表达的蛋白质谱作进一步的G0和KEGG 生物信息学分析。3、研究结果组织特异性的蛋白质为679个。由特异表达蛋白质的生物学过程富集结果显示, 特异表达蛋白质主要参与了损伤反应、免疫反应、炎症反应、补体激活及血液凝固等生物过程。特异表达蛋白质主要构成细胞外基质、血小板、分泌颗粒、脂蛋白复合体以及囊泡等细胞组分。特异表达蛋白质主要发挥了与糖类结合、酶抑制剂激活以及与钙离子结合等功能。富集于补体及凝血通路、系统性红斑狼疮通路、ECM 与受体结合通路、细胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信号通路、白细胞跨内皮迁移通路、朊病毒疾病通路(CCL5,补体C1qa, C1QB, C1QC, C6, C7, C8A, C8B, C8G)、病毒性心肌炎、Fc gamma R介导的胞吞通路等信号通路。4、第三部分研究结论此部分CTEPH 患者肺动脉血栓内膜的蛋白质组学研究得到679个病变组织特异的蛋白质。特异表达蛋白质主要参与了损伤反应、免疫反应、炎症反应、补体激活及血液凝固等生物过程。富集于补体及凝血通路、系统性红斑狼疮通路、ECM 与受体结合通路、细胞粘附分子通路、Fc epsilon RI信号通路、白细胞跨内皮迁移通路等信号通路。第四部分心肺运动试验在预测CTEPH 中的作用1、研究目的在这部分研究中, 我们评估了APE 存活者三种不同的预后状态, 以期发现敏感的心肺运动试验的疾病监测指标。2、研究方法2.1研究对象：自2011年1月至2014年5月间连续入选符合标准的, 在我科住院的66名CTEPH 患者、44名慢性PE 患者、15名PE 痊愈患者。慢性PE, PE痊愈患者以及3例CTEPH 来自2011年1月起始的中国肺栓塞注册登记研究(2011BA11B17).36名健康成年人作为对照组。2.2心肺运动试验：在医生监督下进行症状限制的功率递增式直立踏车运动试验。先进行3分钟静息数据采集后开始3分钟的无负荷踏车运动, 继之3分钟的持续功率递增直至最大耐受量。气体交换采用逐次呼吸测量系统：功率递增幅度的选择根据对患者病史包括日常运动量和运动强度、体格检查和肺功能状况综合决定。递增方案：CTEPH 组、CPE 组为10～15 W/min,对照组为10～30 W/min。2.3统计分析：连续数据组间比较采用方差分析；分类变量的组间比较采用卡方检验。Pearson 或Spearman 相关分析临床数据与VE/VC02斜率、VD/VTphy、最低点VE/VCO2比值。多变量线性回归分析明确CPET 中的独立预测CTEPH 的指标。受试者工作曲线(receiver
operator characteristic curve, ROC)分析预测效力。以ROC 曲线的最佳截点分类待
测数据, 应用单变量和多变量logistic 回归分析建立预测模型。3、研究结果CTEPH 患者的最低点VE/VC02比值比慢性PE 组和PE 痊愈组明显增高(43.4L/min vs 29.9 L/min vs 27.1 L/min, p
凝血因子V Leiden突变与肺栓塞的关系
近年来肺栓塞（PE ）逐渐成为常见病和多发病，但由于PE 的临床症状多样化且缺乏特异性，以及对其缺乏诊断意识和诊断技术条件限制等原因，PE 仍是一种较难做出诊断的疾病，并且其临床漏诊率、误诊率、致残率和死亡率均较高，深入研究PE 的发病机制、提高对肺栓塞的诊断意识和水平已成为当前面临的一个难题。近年来，众多学者在PE 形成机制，特别是分子水平进行了研究，提出凝血因子V （Factor V，F V）Leiden 突变是形成PE 的重要危险因素，已成为血栓性疾病研究中的一个热点。欧美国家对凝血因子V 基因Leiden 突变研究显示，凝血因子V 的Leiden 突变是遗传性易栓症最常见的病因[1-3]，但国内目前尚无关于凝血因子V Leiden突变与PE 的相关性的大规模流行病学调查资料，相关研究报道也较少。现本文采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR ）技术和Hind Ⅲ限制酶进行酶切实验了解PE 患者凝血因子V Leiden突变情况，并探讨凝血因子V Leiden突变与PE 之间的关系。【目的】：了解PE 患者凝血因子V Leiden突变情况，探讨凝血因子V Leiden突变与PE 之间的关系。【方法】：吉林大学中日联谊医院2012年3月至2013年2月根据肺通气/灌注现象或肺动脉造影等检查结合临床资料确诊的41例PE 患者，诊断标准参照中华医学会呼吸病分会制定的肺血栓栓塞症的诊断和治疗指南[4]、急性肺血栓栓塞症诊断治疗中国专家共识[5]及2008年欧洲心脏病学会急性肺血栓栓塞症诊断治疗指南[6]，同时选取80例性别、年龄匹配的健康对照者。患者组和对照组每人用EDTA 管取外周静脉血2ml ，按DNA 提取试剂盒说明提取基因组DNA[7]。采用PCR 技术扩增凝血因子V 基因相关片段，对确认扩增成功的凝血因子V 基因的PCR 产物，用Hind Ⅲ限制酶进行酶切实验，对Hind Ⅲ酶切实验产物再次进行琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像分析系统进行照相分析。【结果】：1、PCR 扩增结果：患者组和对
照组的凝血因子V 基因PCR 扩增产物大小均为241bp 。2、Hind Ⅲ限制酶酶切结果：患者组和对照组的凝血因子V 基因的PCR 产物，用Hind Ⅲ限制酶进行酶切实验，再对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示片段大小均为241bp ，均为野生型，患者组和对照组的凝血因子V 基因1691位点均为鸟嘌呤（G ），没有突变为腺嘌呤（A ）。【结论】：本研究结果提示患者组和对照组凝血因子V 基因的PCR 扩增产物均未见其扩增序列的改变，即凝血因子V 基因表型均为1691G/1691G，1691位点并没有出现突变，所有患者组和对照组中无凝血因子VLeiden 突变纯合子及杂合子。上述结果提示凝血因子V Leiden突变存在种族、地区差异，在中国人群中，可能没有凝血因子V Leiden突变；凝血因子V Leiden突变可能不是导致PE 的危险因素，并不能作为临床常规筛查指标，可能有其他更为重要的机制促进PE 或静脉血栓形成。凝血因子V Leiden基因突变与PE 的相关性及促进PE 形成的遗传性因素有待进一步研究
易栓症家系抗凝血酶缺陷的基因诊断
人体主要有两大抗凝系统，分别为抗凝血酶（antithrombin,AT ）系统（包括抗凝血酶和肝素，主要抑制具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，如：FXa ，凝血酶等）和蛋白C （protein C,PC）系统（包括蛋白C, 蛋白S, 血栓调节蛋白, 内皮细胞蛋白C 受体等，主要灭活凝血因子Ⅴ和Ⅷ等）。而抗凝血酶系统中的抗凝血酶是人体最重要的抗凝因子之一，约占抗凝活性的70%。1965年Egeberg O[1].在报道一个家族性抗凝血酶缺陷症时第一次提出易栓症（thrombophilia ）一词，意为血栓极易形成状态，之后许多年内，这种抗凝血酶缺陷症成为遗传性抗凝系统功能性障碍的代称。1981年由Griffin J H等首次报道了遗传性蛋白C 缺陷症；随后，在1984年时，发现并报道了遗传性蛋白S （protein S,PS）缺陷症[2-5]。目前国际上已报道的AT 基因突变总计218种以上，报道的AT 缺陷家系不到300例；已报道的PC 基因突变总计262种以上，报道的PC 缺陷家系300多例；已报道的PS 基因突变总计200种以上，报道的PS 缺陷家系400多例。蛋白S 是一种能够在在肝脏、巨核细胞和内皮细胞中合成的抗凝因子，其合成过程中依赖维生素K 参与。PS 的分子量为70kD ，基因定位于3号染色体1区1带（3p11.1-3p11.2）, 含有14个内含子和15个外显子，基因序列全长80kb 。PS 是一种辅助因子，能够辅助活化蛋白C(active protein C,APC)灭活FVa 和F Ⅷa 因子，并辅助APC 能够在血小板和磷脂的表面结合，形成酶与底物的免疫复合物。PS 在血浆中有结合状态和游离状态两种。游离状态是PS 能够发挥活性的状态，约占总PS 的35%；结合状态是PS 能够与补体C4b 结合蛋白（C4b-Bp ）相结合，形成复合物而失去了辅助因子活性，约占总PS 的65%。遗传性PS 缺陷症是由于PS 基因发生突变而引起PS 的表达异常或功能异常的一种常染色体显性遗传病，其常引起患者多部位的反复的形成静脉血栓，如肠系膜静脉血栓、股静脉血栓、腓静脉血栓、甚至肺静脉血栓等，动脉血栓少见。PS 缺陷症在临床上可分为三型：I 型是PS 含量的缺乏，但分子结构与分子功能正常；Ⅱ型是PS 质的异常，分子结构发生改变，不能发挥抗凝作用；Ⅲ型是仅有PS 活性部分即游离部分的减少，而总的PS 含量基本正常。蛋白C 是一种由肝脏合成的丝氨酸蛋白酶原，合成原料需要依赖维生素K 的参与，是人体抗凝系统的一种重要的抗凝因子。PC 的分子量为62kD ，定位于2号染色体，含有8个内含子和9个外显子，基因全长11.2kb 。蛋白S 与蛋白C 、血栓调节蛋白（或称凝血酶调节蛋白）和内皮细胞蛋白C 受体等一起组成蛋白C
系统，参与人体的抗凝系统功能，在抗凝系统中发挥着重要作用。其能够以活化形式的蛋白C 对FVa 和F Ⅷa 因子进行水解灭活使凝血过程中断，并减少FXa 与FVa 的结合而发挥抗凝作用。遗传性PC 缺陷症是由于编码PC 的基因发生突变的一种常染色体显性遗传病，可使APC 生成障碍和FVa 和F Ⅷa 灭活障碍，而导致静脉血栓形成，最常见于下肢深静脉（如髂静脉）血栓等。遗传性PC 缺陷症和遗传性PS 缺陷症均可导致PC 系统的异常，常引起多部位的、反复的静脉血栓形成，亦可见于动脉血栓形成，其临床表现十分复杂。抗凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶（serpins ）抑制剂，主要具有抑制丝氨酸蛋白酶活性的凝血酶、FXa 等因子，是人体重要的抗凝物质。抗凝血酶也称为抗凝血酶Ⅲ（AT Ⅲ）, 由Seegers,Johnson 和Fell 在1950年代进行的早期科学研究中发现，依次命名了四种AT （分别为AT Ⅰ、AT Ⅱ、AT Ⅲ、AT Ⅳ）, 但目前只发现AT Ⅲ有临床意义，通常用AT 代指AT Ⅲ[1]。遗传性抗凝血酶缺陷症属于遗传性易栓症的其中一种，是由于抗凝血酶基因发生突变导致抗凝血酶表达异常或功能异常所引起的一种常染色体显性遗传病，在人群中的发病率为万分之二到万分之五[19-20]，中国人在静脉血栓栓塞症中的发病率为5.75%-7.14%[18]。抗凝血酶缺陷症是导致遗传性易栓症的主要因素之一，多数患者为基因杂合突变导致。目前发现的抗凝血酶基因突变中，错义或无义突变占56%，剪切位点突变占6%，碱基缺失或插入突变占37%，基因重排占1%。国内对抗凝血酶缺陷易栓症的研究相对较少，迄今共报道了11个抗凝血酶缺陷家系。遗传性抗凝血酶缺陷症在临床上可表现为极易反复形成人体某部位或多部位的静脉血栓，如肠系膜静脉血栓、髂静脉血栓、下肢深静脉血栓等，最常见部位为下肢深静脉血栓，有些情况下也可在肺部形成血栓导致肺栓塞；少数动脉血栓可形成心肌梗死、甚至脑梗死。通常情况下，AT 缺陷人群在AT 基因发生突变的遗传性因素作用下，发生静脉血栓栓塞症的风险比正常人群增加了数倍，但AT 基因发生突变的人群不会完全都形成遗传性AT 缺陷症，遗传性AT 缺陷症的发生也同时受到获得性诱因的影响，如手术、创伤、长时间制动、高龄、恶性肿瘤、口服避孕药、妊娠等，在遗传性基因突变和获得性诱因并存的双重作用下，遗传性AT 缺陷症的发生率将会明显增加。至今，国内研究报道的易栓症家系仍不多，本研究拟以两个易栓症家系进行研究，分析其抗凝血酶活性、蛋白C 活性和蛋白S 活性等进行表型诊断，检测其基因序列进行基因突变分析，以确定其所患易栓症的类型，并探讨基因诊断在易栓症类型诊断中的应用。目的1. 对两个易栓症患者及其家系成员进行易栓症表型诊断和基因诊断，并探讨其家系成员发病机制。2. 对两个易栓症患者及其家系成员的抗凝血酶基因进行基因测序和基因突变分析，并比对人类抗凝血酶基因突变数据库，以确定有无抗凝血酶基因相同位点突变的报道。方法1. 收集两个家系资料，采集两个家系成员的血样标本。2. 用发色底物法检测第一个家系9名成员和第二个家系4名成员的AT 活性（AT ：
A ）、蛋白S 活性（PS ：A ）、蛋白C 活性（PC ：A ）；AT 抗原量（AT ：Ag ）检测采用免疫比浊法；同时检测其肝肾功能、凝血四项、D-D 二聚体、狼疮抗凝物、抗心磷脂抗体等。3. 用Western blot检测血浆中的AT 分子量和含量。4. 对两个家系成员的外周血进行全基因组DNA 抽提，用PCR 对AT 基因的7个外显子及其侧翼序列进行扩增，经纯化后，用直接测序法对两个家系所有成员的扩增产物进行双向测序分析并进行基因突变检测。5. 同时筛查100例正常人的AT 基因相应位点序列并检索人类核苷酸多态性数据库（SNP ）以排除基因突变的多态性；对两个家系先症者的FV 基因的第10外显子和凝血酶原的第14外显子进行PCR 扩增、产物测序，以排除FV Leiden突变和凝血酶原G20210A 突变；对于突变位点查询
人类抗凝血酶基因突变数据库进行查新检索。6. 图像扫描，数据整理，数据分析。结果1. 第一个家系的先症者AT ：A 和AT ：Ag 分别为48%和121mg/L，其AT 基因的第6外显子发现10381T del，其家系9人中有5名成员检测到相同的缺失突变；2. 第二个家系的患者AT ：A 和AT ：Ag 分别为52.1%和266mg/L，该家系其他成员的PC ：A 、PS ：A 、AT ：A 及AT 含量等项目均正常，AT 基因序列经突变分析未发现异常。结论第一个家系的先症者及部分成员存在Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症，是由AT 基因10381T del引起的移码突变所致，经人类抗凝血酶基因突变库检索，未发现该位点突变的报道；第二个家系不存在AT 基因突变，结合其他检测，患者诊断为获得性易栓症。
凝血酶原基因G20210A 突变与肺血栓栓塞症的关系
肺血栓栓塞症（PTE ）是一种较为凶险的临床急症，容易导致猝死等严重后果，具有较高的死亡率及致残率，对人们的生命及健康造成严重威胁。随着医疗水平的不断提高，PTE 发病率逐年上升，成为一种多发病、常见病。然而，肺血栓栓塞症临床表现缺乏特异性，可以表现为毫无症状，也可以表现为晕厥、休克、甚至猝死，其不典型的临床症状给诊断和治疗带来了一定困难。早期诊断及预防、治疗肺血栓栓塞症成为一个热点。目前，有关肺血栓栓塞症发病机制的研究较少，尤其是分子水平的遗传机制的研究更少。近年来，欧美等西方学者提出，凝血酶原基因G20210A 突变是导致肺血栓栓塞症的重要遗传机制之一[1-3]。然而，目前大多数研究对象多为欧美等白种人，有关我国等其他地域及人种研究较少，东北地区尚未见相关报道。本文采用PCR-RFLP 技术了解肺血栓栓塞症患者中凝血酶原基因G20210A 突变情况，探讨凝血酶原基因G20210A 突变是与我国东北地区人群肺血栓栓塞症的关系。【目的】：了解我国东北地区PTE 患者凝血酶原基因G20210A 突变情况，研究凝血酶原基因G20210A 突变与我国东北地区人群PTE 之间的关系。【方法】：病例组为吉林大学中日联谊医院2012年3月至2013年3月经过螺旋CT 肺动脉造影（CTPA ）或核素肺灌注显像发现充盈缺损综合临床资料确诊的PTE 患者共42例，PTE 的诊断均依据中华医学会呼吸病学分会制定的《肺血栓栓塞症诊断和治疗指南（草案）》[4]、急性肺栓塞诊断与治疗指南[5]制定的诊断标准。对照组为80例主要来自中日联谊医院体检中心及健康志愿者，病例组及对照组均为居住于吉林省5年以上的常住居民，性别、年龄相似。病例组及对照组均抽取外周静脉血2ml ，置于EDTA 抗凝管中。应用美国QIAGEN 公司的DNA 试剂提取盒提取出基因组DNA 。用Eppendorf 公司的PCR 扩增仪对凝血酶原基因的相关片段进行PCR 扩增[6]。确认扩增成功的PCR 产物用HindIII 酶切过夜。最后用凝胶成像分析系统照相分析酶切产物。【结果】：PCR 扩增产物：病例组及对照组Prothrombin 基因经PCR 扩增后均得到大小为506bp 的产物。HindIII 酶切产物：所有病例组及对照组经过PCR 扩增的DNA 片段，由HindIII 酶切后均出现407bp 和99bp2条DNA 带，没有其他条带，表明所有样本PCR 扩增产物没有其他由于基因突变所致的HindIII 酶切位点，仅有1个酶切位点。病例组及对照组中的Prothrombin 基因均为野生型，病例组及对照组中均不存在凝血酶原基因G20210A 突变。【结论】：凝血酶原G20210A 基因纯合子及杂合子突变在病例组及对照组均未出现，HindIII 酶切电泳均未发现由基因突变所致的DNA 片段。这样的结果说明，我国东北地区人群中，可能不存在凝血酶原基因G20210A 突变，该基因突变存在显著的地域及人种差异；对于我国东北地区人群，该基因
突变可能不是肺血栓栓塞症的主要风险因子，凝血酶原基因G20210A 突变不可作为常规筛查肺血栓栓塞症的指标。今后可进一步寻找其他导致肺血栓栓塞症的高危因子。
血栓性血小板减少性紫癜的临床研究及遗传性抗凝血酶缺乏症的分子机制研究 目的血栓性血小板减少性紫癜（Thrombotic Thrombocytopenic Purpura, TTP）属血栓性微血管病（TMA ）的一种，该病发病急骤，死亡率高，是一种临床急重症。随着血管性血友病因子裂解酶（ADAMTS13）的发现和克隆，使我们对TTP 的发病机制有了更为深入的认识。血浆置换的临床应用作为TTP 急性发作期的治疗使该病死亡率从以前的90%降低到10%-20%。综合分析TTP 患者的临床特征、治疗策略及转归，深入了解该病的发生、发展过程及预后，有助于提高临床TTP 诊治水平、降低死亡率及预防复发。方法回顾性分析2007年1月-2012年11月本实验室登记并确诊的60例TTP 患者的病因、临床表现、实验室检查、治疗及转归情况。采用t 检验比较有效组与死亡组的相关变量。相关统计分析采用GraphPad Prism5软件，P
抗体滴度较高患者在疾病随访中可定期检测血浆ADAMTS13及抗体滴度指标，用于预测疾病复发。抗凝血酶（antithrombin ，AT ）是人体内最重要的抗凝物质之一，是由肝细胞分泌的一种相对分子量约58.2kD 的糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制物（serine proteinaseinhibitor, SERPIN）超家族中的一员。通过抑制凝血酶及活化的凝血因子IX 、X 、XI 及XII 丝氨酸蛋白酶的活性维持机体出凝血平衡，其作用约占抗凝系统总活性的70%。长期以来的基础与临床研究已证实AT 缺乏是易栓症遗传性危险因素之一，在亚裔人群中尤为突出，当某些抗凝蛋白发生数量或质量缺陷易引发血栓形成。遗传性抗凝血酶缺乏症由AT 基因突变引起，呈常染色体显性遗传规律，大多伴有家族史，先证者通常以不能解释的双下肢深静脉血栓形成或肺栓塞为主要表现。本组中3例先证者均以反复出现的下肢静脉血栓及肠系膜动脉血栓为就诊的主要原因。实验室检查采用酶联免疫吸附法（ELISA ）和发色底物法分别检测AT ：Ag ，AT ：A 及其他抗凝指标。结果发现，1个家系属I 型AT 缺乏；另2个家系属II 型抗凝血酶缺乏。各家系中部分受累成员实验室检查结果与先证症表现一致，但临床未发生血栓事件，证实遗传性抗凝血酶缺乏在临床表现上存在明显个体差异。采用PCR 法结合核酸测序方法对先`证者及其家族中其他成员抗凝血酶基因的7个外显子及其两翼内含子序列进行扩增、测序分析，发现3种杂合基因突变，其中2个无义突变和1个错义突变，分别为T401X ，R132X ，L78P 。其中T401X 及L78P 为国际首次报道。部分受累家系成员的基因突变检测结果与先证者一致。证实3例遗传性抗凝血酶缺乏症患者的基因突变引起血浆中抗凝血酶含量降低，是导致静脉血栓栓塞症的分子机制。AT 突变的分子特点为研究抗凝血酶蛋白结构与功能关系提供重要的信息。
亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 和内皮胞蛋白C 受体A6936G 基因多态性与深静脉血栓形成的相关性研究
研究背景：深静脉血栓形成(DVT)是指血液在深静脉内不正常凝结, 阻塞管腔, 导致静脉回流障碍的一种疾病。深静脉血栓形成的主要症状为肢体肿胀和疼痛, 症状随着血栓的蔓延可能会逐渐加重, 少数严重病例可以发生股青肿甚至静脉性坏疽。而且如果不能及时妥当地诊断和处理, 有些症状会长期迁延, 最终会演变为静脉血栓形成后综合征, 长期影响患者的生活质量；还有一些病人可能会因血栓脱落而形成肺栓塞, 直接危及病人生命, 或者演变为慢性栓塞性肺动脉高压。目前, 我国DVT 的发病率尚无确切的统计资料, 据国外资料报道, 美国DVT 年发病率约为千分之一。个半世纪以前,Rudolph Virchow提出了血液瘀滞, 血管壁的变化, 和血液高凝状态是机体发生发展静脉血栓的主要机制, 这个理论现今仍然适用, 基本上所有的导致血栓的因素, 都影响这三种机制之一。目前认为有很多导致个体易患静脉血栓的因素, 可分为两类：一种是环境及后天生理病理因素的改变, 如外伤, 妊娠, 围手术期, 恶性肿瘤, 机体制动, 药物等影响机体的凝血机制；另一种是由遗传基因突变参与的凝血机制异常, 有研究认为遗传基因突变在大于30%的个体参与到了深静脉血栓的发生过程。人们对各种基因多态性与血栓形成之间的关联性做了相当深入的研究, 也发现了越来越多的基因多态现象确实参与到了凝血机制的改变和调节, 并与静脉血栓构成相相关性。目前有研究认为亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性由于会导致亚甲基四氢叶酸还原酶活性下降, 进而影响同型半胱氨酸代谢, 形成高同型半胱氨酸血症, 从而促进血液高凝, 增加机体血栓形成的风险；内皮细胞蛋白C 受体A6936G 基因多态性由于会提高血浆sEPCR 的水平
进而增大SEPCR 对蛋白C 抗凝途径的负向调节, 从而形血液高高凝, 增加机体血栓形成的风险。对这两类基因多态现象的研究已经成为热点, 本课题以临床病例为基础, 采用一定的试验方法, 对亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性和因皮细胞蛋白C 受体A6936G 基因多态性与深静脉血栓形成的相关性进行了研究。第一部分亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性与深静脉血栓形成的相关性研究亚里基四氢叶酸还原酶(MTHFR)在同型半胱氨酸(Hey)代谢中起着关键作用, 可以催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换为5甲基四氢叶酸, 从而成为甲基的提供者参与维生素B12依赖的同型半胱氨酸向蛋氨酸转化；MTHFR 降低, 会导致Hey 的代谢障碍, 进而形高同型半胱氨酸血症。最近的研究已经证实高血浆Hey 浓度是在深静脉血栓形成的勺危险因素之一，而MTHFR(C677T基因多态性已被报道可能会产生MTHFR 酶的热不稳定性以及一定程度上降低该酶的活性, 进而形成高同型半胱氨酸血症, 从而导致机体易形成血栓。为了进一步深入研究探讨这一理论, 我们设计了本项病例对照研究。目的与方法探讨血Hey 水平及MTHFR C677T基因多态性与DVT 发病的关系。在本课题的病例对照研究中, 我们分析了DVT 患者的MTHFR 基因C677T 多态性各基因型的频率，并与正常对照进行比较。此外, 通过检测受试者血浆Hey 水平，我们评估这一多态性与血浆Hey 水平之间的关联, 以及血浆Hey 水平与DVT 的关系。应用酶联关免疫吸附试验(ELISA)检测血浆Hey 水平，采用限制旧性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR RFLP)技术测定基因组DNA 。结果MTHFR 基因在677位置菜有3种基因型CC ，CT 和TT 基因型，T 为突变等位基因。在DVT 组,T 等位基因频率明显高于对照组。与CC 基因型相比,TT 基因型与DVT 相关的风险显著增加(OR=3.200；95%CI,1.2937.922，P=0.010。与等位基因(相比, 突变等位基因T 与DVT 的风险增加相关
(OR=1.712;95%CI,1.095-2.675,P=0.018),DVT组的血浆Hey 水平显著高于对照组而且MTHFR 基因C677T 突变对于血浆Hey 水平有影响, 突变等位基因T 与血浆Hey 水平升高有关。结论MTHFR677位点基因突变与个体发生DVT 的风险增加之间存在关联。突变纯合子可以导致DVT 、风险增加, 突变等位基因T 也与DVT 风险增加有关。DVT 患者有着比健康人群更高的血浆同型半胱氨酸水平, 而且MTHFR 基因C677T 突变对于血浆Hcy 水平有影响, 突变等位基因T 与血浆Hey 水平升高有关。结论是,MTHFR C677T基因多态性可能是DVT 发生的危险因素之一, 而这种关联可能是通过血浆Hcy 的浓度变化实现的。第二部分内皮细胞蛋白C 受体A6936G 基因多态性与深静脉血栓形成的相关性研究已知蛋白C (PC)系统是一种重要的抗凝血机制, 在其辅酶蛋白S(PS)存在的条件下, 活化蛋白C (aPC)使因子Va 和Villa 失活, 从而减少凝血酶生成。内皮细胞蛋白C 受体(EPCR),是一种在血管内皮细胞的表面的受体。这种受体可以与PC 或aPC 结合。这种结合可以提高PC 的活化效率, 加速aPC 对因子Va 和Villa 灭活, 从而实现抗凝。而可溶性内皮细胞蛋白C 受体(sEPCR)在金属蛋白酶作用下从EPCR 脱落, 也可以与PC 和aPC 结合, 但它与EPCR 作用相反, 而且产生了与EPCR 的竞争性抑制, 从而抑制了aPC 的抗凝活性, 导致高凝。因此血浆sEPCR 水平被认为与机体的高凝倾向有关,sEPCR 水平升高会导致机体易患血栓, 而EPCR 基因突变可能会产生sEPCR 水平的升高。为了进一步探讨这个理论, 我们对EPCR A6936G多态性、血浆sEPCR 水平和DVT 之间的关系进行了深入的研究。目的与方法本研究通过检测DVT 病人以及正常对照人群EPCR A6936G多态性分布, 并通过测定血浆sEPCR 表达水平, 探讨其在DVT 形成中的作用。病例组由已确诊的DVT 患者组成, 对照组来自健康查体者。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血. 浆sEPCR 水平, 采用限制性片段长度多态性聚合酶
链反应(PCR-RFLP)技术测定基因组DNA 。结果DVT 组突变等位基因G 的频率显著高于对照组。相对于AA 基因型,AG 基因型(OR=2.502;95%CI,1.215-5.153),和等位基因G 携带者AG+GG(OR=2.507;95%CI,1.238-5.076),都表现出增加了DVT 的发生风险。突变等位基因G 相对于等位基因A, 也增加了DVT 发生的风险(OR=2.178；95%C1,1.159-4.093)。DVT 组血浆sEPCR 水平显著高于对昭组, 而突变等位基因G 与血浆sEPCR 水平升高有关。结论EPCR6936的基因突变与机体DVT 发病的敏感性有关, 突变等位基因G 导致DVT 发病危险增加。DVT 患者具有比健康群体史更高的血浆sEPCR 水平, 而且血浆sEPCR 水平与EPCR A6936G基因多态性存在关联, 基因突变会导致血浆sEPCR 水平升高。结论是,EPCR A6936G的基因多态性与血浆sEPCR 水平升高有关, 其可能是人群中发生DVT 的危险因素之一。课题创新性与意义一本研究结合了流行病学的研究方法和分子生物学的实验技术, 首次同期联合检测了DVT 患者和健康人群的MTHFR 基因C677T 和EPCR 基因A6936G 多态性的分布以及与其关联的功能蛋白Hey 和sEPCR 的表达水平, 确定两个基因多态性与DVT 之间的联系, 以及基因多态性与功能蛋白表达水平的关系。为从病因学上在基因水平研究血栓性疾病增加了新的认识。二. 本课题体现了“基因-蛋白-疾病”的研究思路, 由于本研究对象集中于特定的地理区域(山东), 实验结果具有一定的地域代表性, 同时实验结论也具有临床指导意义；此外, 本研究从方法学上为进一步研究基因多态性提供了一定依据。