分子生物学实验指导

分子生物学实验

从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因

一、实验思路与设计：

目的基因的获取是基因工程的重要步骤，也是研究基因的进化、功能等的必要手段。本实验设计从基因组DNA提取开始，通过DNA的提取及质量检测、常用生物信息库的查询、电子延伸、DNAstar软件的使用、PCR仪的编程与使用、载体构建、感受态细胞的制备、重组子的筛选和扩培、质粒的提取与检测等实验，使学生掌握基因克隆的基本思路和方法。

谷胱甘肽硫转移酶（GSTs，EC 2.5.1.18）是分子量为25-29kD的同源或异源二聚体酶类。其作用是将将谷胱甘肽转移到各种有毒物质的亲电分子上去。GSTs在机体有毒化合物的代谢、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击中起重要作用。此外，亲电子致癌物可被GSTs分解，所以GSTs有抑制细胞癌变的功能（Seidegard J，et al.，1997）。谷胱甘肽硫转移酶作为一种具有广谱抗氧化活性的物质已用于癌症等疾病的治疗。

编码GSTs的基因是一类古老而且广泛存在的基因家族。植物GSTs家族各成员之间的差异很大，它们只有一个长15个氨基酸的保守域（Marrs，1996）。Droog等人（1995）建议根据序列保守性，免疫交叉反应活性和基因内含子和外显子的结构将植物的GSTs分为三个亚类，I型GSTs有两个内含子，其翻译和转录受诸如脱水（Kiyosue et al.，1993），损伤（Kim et al.，1994），活性氧（Bartling et al.，1993），病原菌攻击或激素（生长素和乙烯）（Zhou and Goldsbrough，1993；Akahashi et al.，1995）的影响。II型GST的序列有9个内含子，此类型的GST序列只在荷兰石竹中发现（Meyer et al.，1991；Itzhaki and Woodson，1993）。III型GSTs只有一个内含子，其转录和翻译受各种植物激素（Takahashi et al.，1989，Droog et al.，1993）、病原菌侵袭（Taylor et al.，1990）及重金属（Czarnecka et al.，1988；Hagen et al.，1988，Marrs and Walbot,1997）的诱导。

研究植物GST最初目标在于确定不同作物对除草剂的抗性，但是对其在细胞正常代谢过程中所起的作用知道的较少（John and Kathryn，1998；Mars,1996）。

对麦类作物GST的研究主要集中在其抗除草剂的作用上，由抗除草剂诱导的在小麦中表达得到的GST主要是I型的GST，它们只含有一个内含子并将其定位在小麦的第六部分同源群上（Riechers et al.，1994，1996 a，1996 b，1998）。

本实验采用同源序列克隆的方法从小麦基因组克隆小麦GST的基因组序列。

二、具体实验安排

实验一 小麦基因组DNA提取

小麦种子表面消毒后浸泡在蒸馏水中浸泡12小时，露白后转入培养皿中，室温条件下生长至两叶一心时采集叶片，立即用液氮处理后，置于-70℃冰箱中保存备用。

总DNA采用Sharp等（1989）提出并经Devos等（1992）改进的酚—氯仿法提取。具体步骤如下：

1） 将适量新鲜叶片液氮低温下磨碎，取适量置于1.5ml离心管中，加500l“S” beffer（100mM Tris.HCl pH8.0，100mM NaCl，50mM EDTA pH 8.0，2% SDS，(现配现用) 65℃预热），65℃水浴约1h。

2） 加入500l酚—氯仿（1∶1），混匀后10000rpm离心10min；取上清液加入0.6 倍体积异丙醇，混匀并静置一会儿后，10000rpm离心10min，倒掉液相，用200ul 70%乙醇将DNA洗1-2次后干燥。

3） 将DNA溶于500l1×TE（pH 7.0），加5lRNA酶（10mg/ml），37℃保温1h；加500l氯仿，轻轻混匀后10000rpm离心10min。

取上清液加入2倍体积冷无水乙醇（或95%乙醇），轻轻混匀并静置一会儿后10000rpm离心10min，轻轻倒掉液相，待DNA干燥后溶于25ul 1×TE（pH 7.0）。

实验二 从小麦基因组中克隆谷胱甘肽硫转移酶基因

根据GeneBank上公布的具有基因组序列的两个小麦GST序列GSTA1（X56012）和GSTA2（X56004）及其它小麦GST的mRNA的保守序列设计如下引物：

引物

名称

Gcds

Foward Gcds

Reverse 30 5’TTAAAGCAAGGAATCCGGGCTCGCACGAGC3’ 碱基 长度 28 5’ATGTCTCCGGTGAAGGTGTTCGGGCAC3’ 碱基序列 产物长度 gDNA 1.1kb cDNA 900bp

引物Gcds开始于起始密码子结束于终止密码子，其cDNA的扩增产物应该包含完整的开放阅读框。

基因组PCR反应体系

以基因组DNA进行基因组PCR。PCR反应总体积为20l，反应液组成：

10×Buffer

MgCl2 （25 mmol/L）

dNTP （10 mmol/L）

Taq （2.5 U /l）

Primer F（5mol/L）

Primer R（5mol/L）

模板（gDNA）

ddH2O

Total

基因组PCR反应程序

2.0l 1.50l 0.5l 0.4l 1l 1l 50-80ng 20l

扩增条件为95℃5min，94℃1min，67℃1min，72℃1min，30个循环，72℃10min，然后4℃保温。

扩增产物的检测

大于300bp的片段用1.2%的加EB的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检测。

实验 3 PCR产物的纯化及连接

选用PCR凝胶回收纯化试剂盒进行（按照实际说明书操作，下面仅是参考）

1） 100ul的PCR产物在1.0%的琼脂糖胶上电泳，在紫外灯下用洁净消毒的刀片将目标片段挖出，放入1.5ml离心管中。

2） 向1.5ml离心管中加3倍体积的溶胶液，50oC水浴10分钟，待凝胶完全溶解后，倒入回收离心柱中。

3） 向回收柱中加入700ul漂洗液，13000rpm离心1分钟。

4） 倒出离心管中漂洗液，再向回收柱中加入500ul漂洗液，13000rpm离心1分钟。

5） 将离心管中的漂洗液倒掉， 13000rpm离心2.5分钟。

6） 将回收柱转移至一个新1.5ml离心管上，加入适量ddH2O，静置30分钟。

7） 13000rpm离心1min，弃纯化柱，离心管内即为高纯度的PCR纯化产物。

PCR产物的连接

选用天为时代公司的连接试剂盒，载体为pGEM-T easy；感受态细胞为TOP10,连接体系为：

T4 DNA ligase

10×T4 DNA ligase Buffer

pGEM-T easy

PCR products

Total

25℃下连接12-16h。

实验 4 大肠杆菌感受态制备

[实验目的]

通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备。所用菌株是DH5a

[实验原理]

细菌处于易于吸收外源DNA的状态叫感受态。细菌处于0℃的CaCl2低渗溶

液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃段时间短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

[实验步骤]

1.挑取大肠杆菌单菌落接种于10 mL LB培养基中，37℃ 振荡培养过夜。

2.按1%接种量接种10 mL LB培养基中，37℃快速振荡培养3 h。

3.取1ml培养物，冰浴30 min ，12,000 r/min离心1 min，去上清。

4.加二分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，重新悬浮细菌沉淀，

12,000 r/min离心1 min，去上清。

5.加十分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，重新悬浮细菌沉淀，

12,000 r/min离心1 min，去上清。

6.加二分之一体积的冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，重新悬浮细菌沉淀，冰

浴3 h-24 h，即为大肠杆菌感受态细胞。

1μl 1μl 1μl 7μl 10 μl

实验5 PCR连接产物的转化

[基本原理]

将质粒DNA导入细菌的过程称为转化（Transformation）。此感受态细菌细胞在CaCl2低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，见前）。质粒DNA与CaCl2 形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。在选择性培养平板上，可选出所需的转化子（即含有质粒DNA的细菌）。钙处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子。除化学方法转化细菌外，还有电穿孔法（Electroporation），其转化率可高达109～1010个转化子/μg质粒DNA。

[实验步骤]

1） LB固体选择培养基的配制

Bacto trytone

Bacto yeast extract

NaCl

H2O

IPTG （200mg/ml）

X-gal （20mg/ml）

Ampicillin （50mg/ml）

2） 转化连接液的配制

E. coli TOP10

PCR连接液

3） 应用热激法进行转化

冰浴30 min后，42℃热激90 s，马上放回冰上，冰浴2 min；加400 µL LB培养基，37℃水浴静置15 min；再于37℃摇床慢摇振荡培养45-60 min；取50-100 µL涂在含有氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB固体培养基上，37℃100μl 5μl 2g 1g 1g 100ml 28μl 120μl 100μl

倒置培养过夜。

4） 将适量复苏后的转化液涂于LB选择培养基上，于37℃倒置培养16-18 h。白色菌落即重组质粒。

实验6 重组质粒的提取与检测

质粒提取

1.挑取单菌落接种于2 mL含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB培养基中培养，37℃培养过夜。

2.取1.5 mL细菌培养物，加入微量离心管中，8,000 r/min离心1 min。

3.除净上清，加100μL溶液I，剧烈振荡混匀。

4.加200 µL溶液II（先加400ul水+50ul 2M NaOH+50ul 10%SDS,按此顺序加样，现用现配，够2人份使用），盖紧管盖，迅速颠倒混匀。

5.加150 µL冰冷的溶液III（冰上预冷），盖紧管盖，颠倒混匀，冰浴10 min。

6.12,000 r/min离心10 min，将上清转移到一个新的干净指管中。

7.向上清中加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温作用15 min ，12,000 r/min离心10 min 。

8.弃上清，70 %乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干。

9.用适量含100 µg/ml RNA酶的TE溶解沉淀，65℃作用30 min。

10.加等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），反复颠倒混合，进行抽提, 12,000 r/min离心10 min 。

11.反复抽提至两相界面无蛋白出现，再用氯仿-异戊醇（24：1）抽提一次。

12.取水相，加2倍体积无水乙醇及十分之一倍体积的3 mol/L NaAc(pH5.2)，混匀，-20℃放置半小时以上，12,000 r/min离心10 min；弃上清，用预冷的70 %乙醇洗沉淀一次，倒扣在纸巾上凉干，用适量TE溶解沉淀，-20℃存放备用。

实验7 质粒检测(见扩增产物的检测)