种子处理对西瓜细菌性果斑病的防治效果

　　摘 要： 利用干燥与药剂相结合、引发与药剂相结合的种子采后处理方法对西瓜种子的除菌效果进行了研究。应用PCR方法检测未经人工接种的西瓜种子，幼苗生长方法检测人工接种和自然带菌（Ac）的西瓜种子，结果表明，未经人工接种的西瓜种子中，从没有发酵经室内阴干4 h后热风烘干、以及不管是否发酵室内阴干的种子上均检测到Ac菌的特异性条带。人工接种Ac菌的西瓜种子随着室内阴干时间的延长，幼苗细菌性果斑病（BFB）的发病率呈上升的趋势，由阴干 3 h的0.9% 上升到阴干 6 h的20.4%。同时随着阴干时间的延长，种子的成苗率降低，由阴干 3 h 的52.6%下降到阴干6 h的23.9%。说明快速干燥能有效控制带菌种子幼苗BFB的发生，提高种子的健康质量。不同杀菌剂对自然带菌（Ac）西瓜种子杀菌效果的研究结果表明，不管是药剂处理种子还是含药的固体基质引发处理种子，其种子质量都没有显著的差别。药剂处理的种子平均每株幼苗的鲜质量均高于含药的固体基质引发处理的种子幼苗的鲜质量。通过幼苗生长鉴定，含药固体基质引发处理的相对防治效果在57.1%～78.6%之间，而药剂处理的相对防治效果在84.6%～100.0% 之间。含药的固体基质引发处理对降低幼苗BFB发病率的效果要差。 　　关键词： 西瓜； 细菌性果斑病； 种子处理； 快速干燥； 防治效果 　　瓜类细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，简称BFB）是一种严重危害葫芦科作物的世界性病害，尤其以危害西、甜瓜为重。西瓜细菌性果斑病最早于1965年由Webb等[1]首次在美国佛罗里达州发现，并对症状进行了描述。当Somodi[2]和Rane[3]等人报道了1989年在美国佛罗里达商品西瓜生产中的发病情况，接着先后在美国东南部10多个州再度严重发生西瓜细菌性果斑病，并导致严重的经济损失后，才真正引起了人们的重视，并称之为西瓜细菌性果腐病。该病一旦发生，即可能造成严重的经济损失。从1989年以来，大多数年份美国发生该病的地块不到5%，但是一旦受害，其损失有99%～100%。该病在美国印地安纳州迅速蔓延后，80%的西瓜不能上市销售。西瓜细菌性果斑病已对美国的西瓜制种业和种植业造成了巨大的冲击和重大的威胁。目前该病还在土耳其[4]、澳大利亚[5]、日本[6]等国造成严重危害。 　　我国在1990年首次报道了BFB，随后就相继有人记载和报道了该病在国内许多西甜瓜产区的发生和危害[7-11]。该病发生在育苗阶段，可造成嫁接幼苗大量死亡，在大田发生可造成西甜瓜减产甚至绝收，给西甜瓜生产带来巨大的经济损失。瓜类细菌性果斑病可经种子传播，我国作为国际上很多大型种子公司的制种基地，由于细菌性果斑病的发生，使得美国的部分瓜农不愿意使用中国生产的种子，致使国际上一些瓜类制种商先后撤出中国，使中国的西瓜制种业蒙受了巨大的经济损失。 　　该病主要通过种子带菌传播，在生产上使用健康无菌的种子是防止细菌性果斑病发生和传播的关键措施，目前迫切需要行之有效的种子灭菌处理技术。国外有关种子灭菌处理早有报道[12-14]，目前我国也有不少相关研究[15-19]，但是单一一种处理方法都无法对种子进行完全消毒。本研究旨在摸索多种方法的综合应用对采后种子进行处理，从而减少种子带菌给西甜瓜生产所造成的巨大损失。 　　1 材料和方法 　　1.1 快速烘干对西瓜细菌性果斑病种子带菌的影响 　　1.1.1 试验材料 试验选用2种类型的种子：不经人工接种的西瓜种子、人工接种的西瓜种子。从没有发现西瓜细菌性果斑病疫情的大田新鲜西瓜上采集种子作为不经人工接种的西瓜种子，分成2部分：一部分种子马上冲洗干净，另一部分种子发酵48 h，冲洗干净，分别分成4份进行以下处理：（1）马上烘干，烘干时间为3 h；（2）室内晾4 h后烘干；（3）1% 盐酸处理15 min后烘干；（4）室内自然晾干。种子的带菌情况采用幼苗生长和PCR技术对以上处理的种子进行检测。 　　人工接种的西瓜种子从市售的健康西瓜上采集，冲洗干净后分成5份，其中4份立即用浓度为3×104 cfu·mL-1细菌性果斑病菌悬浮液浸泡30 min并进行以下处理：（1）立即烘干；（2）室内晾3 h后烘干；（3）室内晾6 h后烘干；（4）室内晾9 h烘干。另外 1份在室内自然晾干后，在新鲜的西瓜汁液中浸泡2 h，然后用浓度为3×104 cfu·mL-1细菌性果斑病菌悬浮液浸泡30 min，自然晾干，采用幼苗生长检测发病情况。 　　1.1.2 种子干燥处理 使用5HG-3550型滚筒烘干机在40 ℃ 的条件下烘干种子。种子快速烘干机是由北京蔬菜研究中心和现代农装科技股份有限公司共同研制的。 　　1.1.3 Ac菌悬液的制备 供试菌株为Pslbtw 20，由中国农业科学院植物保护所提供；挑取保存的供试菌株在YDC斜面培养基上活化培养24 h，用无菌水配成菌悬液，利用紫外分光光度计在波长600 nm测量菌悬液的OD值，用无菌水调整OD值在0.1左右（菌液浓度约为1×108 cfu·mL-1），再稀释至3×104 cfu·mL-1，备用。 　　1.1.4 幼苗生长鉴定 幼苗生长鉴定在50穴的育苗盘内进行，基质为经高压灭菌的蛭石，每一个穴内播种1粒种子，育苗盘播种后用薄膜覆盖保湿，放置在25～30 ℃、16 h光照的条件下生长，出苗后去掉薄膜，每天观察幼苗的发病情况，直到播种后3周。 　　1.1.5 种子带菌的PCR检测 提取种子的浸提液进行PCR，每个处理检测1 000粒种子混合样品。PCR的引物组合为WBF1（5’-GAC CAG CCA CAC TGG GAC-3’）和WBF2（5’-CTG CCG TAC TCC AGC GAT-3’），由北京赛白盛公司合成。种子的浸提及PCR的方法按照宋顺华等[20]的方法进行。 　　1.2 药剂处理带菌种子对种子质量的影响及防治效果 　　1.2.1 试验材料 供试药剂：选用6种常用抗细菌的药剂配制药液，每种药剂2个浓度，以无菌水和不处理作为对照：1%盐酸，2%盐酸；3%双氧水，5%双氧水；3%过氧乙酸，5%过氧乙酸；1 ∶ 100 physan 20，1 ∶ 80 physan 20；0.1% CuSO3，0.2% CuSO3；0.2% 农用链霉素，0.4% 农用链霉素。 　　种子：带菌的西瓜种子为京欣2号，由北京蔬菜研究中心西瓜课题组提供。 　　采用2种方法处理种子。方法1：用以上浓度的药液直接处理带菌的西瓜种子。盐酸溶液处理种子10 min，physan 20处理种子15 min，其他处理种子20 min，然后充分冲洗干净。冲洗干净的种子置于室内自然晾干，保存在低温条件下备用。方法2：药剂处理与固体基质引发结合。按照本试验室引发西瓜种子的方法[21]将以上浓度的药液加入到固体基质中处理种子，回干后的种子保存在低温条件下备用。 　　1.2.2 种子发芽率和幼苗生长特性的测定 处理后的种子分别进行发芽试验：每处理50粒种子，4次重复，共200粒种子，发芽基质为蛭石，发芽条件为25 ℃恒温、16 h光照、8 h黑暗，计算种子的发芽势、发芽率。发芽后14 d测定幼苗的生长特性，连根拔出种苗，用水洗净后放在滤纸上吸去多余水分。每处理随机抽取50株苗，测量每株苗的长度，称量50株苗的总质量，计算平均每株苗的长度和鲜质量。 　　1.2.3 防病效果的检测 每处理播种500种子进行幼苗生长鉴定，检测各处理的灭菌防病效果，检测方法同1.1.4。 　　2 结果与分析 　　2.1 快速烘干对种子带菌的影响 　　对大田新鲜西瓜上所采集的西瓜种子进行各种处理后，采用幼苗生长鉴定方法检测各处理幼苗细菌性果斑病的发病情况。由于所有处理种子所生长的幼苗都很弱小，而且猝倒病严重，幼苗的成活率很低，特别是室内自然晾干的种子幼苗的成苗率更低，没有有效地观察到幼苗的发病情况。 　　应用PCR技术，从没有经过发酵在室内晾干4 h后烘干的种子，以及不管是否经过发酵，在室内自然晾干的种子上均检测到了病原菌Ac的特异性条带（360 bp），结果为阳性。不管是否对种子发酵，采种后快速烘干、盐酸处理的种子及发酵后在室内晾干4 h的种子均没有检测到Ac的特异性条带（图1），说明种子发酵、采种后快速烘干、盐酸处理均可阻止病原细菌在种子表面的繁殖，是防止种子带菌的有效方法。 　　人工接种的西瓜种子采用幼苗生长方法检测结果表明，用菌悬液处理后的西瓜种子随着室内晾干时间的延长，幼苗细菌性果斑病的发病率呈上升的趋势，晾干 3 h以上时，幼苗的病株率急剧上升，由0.9%上升到晾干 6 h的20.4%。但是随着晾干时间的延长，幼苗的死亡数量也在增加，成苗率降低，晾干 3 h以上时，种子的成苗率急剧降低，由52.6%下降到 6 h的23.9%（图2）。由此说明种子的快速烘干可以降低西瓜种子的带菌率，降低幼苗细菌性果斑病的发病率，提高种子的健康状况。 　　Ⅰ. 立即烘干；Ⅱ.室内晾3 h后烘干；Ⅲ.室内晾6 h后烘干；Ⅳ.室内晾9 h烘干；Ⅴ.自然晾干 　　2.2 药剂处理带菌种子对种子质量的影响及防治效果 　　2.2.1 药剂处理对西瓜种子质量的影响 不管是药剂处理的种子还是含药的固体基质引发处理的种子，其发芽势和发芽率与对照相比在5%的显著性水平上都没有明显的差别，各处理之间也没有明显的差别（表1）。但药剂处理的种子平均每株幼苗的鲜质量均高于含药的固体基质引发处理的种子（图 3）。 　　2.2.2 不同药剂处理对西瓜细菌性果斑病的防治效果 通过幼苗生长鉴定，与对照相比，本文所选用的杀菌剂采用2种方法处理带菌种子后，都显著地降低了幼苗细菌性果斑病的发病率，各处理种子幼苗的发病率远远低于未处理的对照种子，对照幼苗的发病率为5.5%～6.0%，含药固体基质引发处理西瓜幼苗的发病率在1.5%～3.0% 之间，药剂直接处理种子幼苗的发病率在0～1.0%之间（图4），其相对防治效果分别为57.1%～78.6%、84.6%～100.0%（图5）。含药固体基质引发处理种子对降低幼苗发病率的效果更差。 　　3 讨 论 　　瓜类细菌性果斑病是一种典型的种传病害，种子带菌是主要的初侵染源，在合适的环境条件下，少量的带菌种子能给葫芦科作物生产田造成毁灭性的危害[22] ，因此带菌的种子可成为商品西瓜甜瓜产区的重大隐患。生产健康的种子，防止种子带菌和对带菌种子进行灭菌处理是有效控制该病在田间发生发展的主要措施之一[23]。健康种子的生产首先要避免从出现BFB疫情的大田及带有典型BFB症状的西瓜上采种，但从没有BFB典型症状的西瓜上所采收的种子也很难确定种子是否带菌。其次种子采后进行种子发酵和酸性物质处理能极大地降低种子的带菌率，如果在气温较低的条件下，发酵24 h的处理效果不理想，发酵72 h对种子的发芽率会产生影响，以发酵36～48 h较为适宜，但没有100% 的有效[13-14]，因为病原菌可以侵染到种子的内部[24]，种子发酵不能杀死种子内部的病原菌，也有可能是种子发酵后在干燥过程中再次感染病原菌。 　　本研究采种的大田西瓜植株没有发现BFB，所采集的西瓜种子籽粒很小，在苗盘播种后发芽整齐但很弱小，因此在有利于BFB发病的高温高湿条件下猝倒病严重，造成成苗率很低，没有有效的检测到幼苗BFB的发病情况。本试验采用PCR方法，不管是种子发酵还是不发酵，从采种后立即烘干的种子、盐酸处理过的种子以及发酵48 h 后晾干4 h以内迅速干燥的种子上均没有检测到病原菌的特异性DNA片段。采用幼苗生长方法检测人工接种病原菌的西瓜种子，随着室内晾干时间的延长，幼苗BFB的发病率上升，幼苗的成苗率降低；晾干 6 h种子的成苗率与晾干3 h相比急剧下降，其中一部分原因是幼苗的猝倒病而引起的。由此说明种子的快速干燥可以降低西瓜种子的带菌率，从而降低幼苗BFB的发病率，提高种子的健康质量。本研究的结果表明，采后使种子表面干燥的时间不能超过4 h，种子发酵、采种后快速干燥、盐酸处理均可阻止病原细菌在种子表面的繁殖，将这些处理措施综合使用是防止种子带菌的有效方法。 　　杀菌剂处理带菌种子的研究结果表明，生产上经常使用的6种抗细菌的药剂分别用2种方法和2种浓度处理种子后，与对照相比，对种子的发芽势和发芽率都没有影响，但幼苗的平均鲜质量在2种方法之间有明显的差别，除5% 的双氧水外，其余的杀菌剂用含药的固体基质处理后，与药液直接处理种子相比，可减轻幼苗的鲜质量。这可能是含药的固体基质处理种子是一种引发的过程，处理时间较长，在这个过程中种子缓慢吸收了药液到种子内部，对幼苗产生影响。从各处理对幼苗BFB的防治效果可以看出，相同浓度的药液通过固体基质引发处理种子，其杀菌效果远远不及药液直接处理种子。本试验中将一定浓度的杀菌剂加入固体基质，是为了使种子引发与杀菌同时完成。以后的研究还需进一步摸索固体基质中药剂的种类和适宜的浓度，达到既能使种子不携带病原菌又不影响种子质量、出苗整齐的目的。 　　4 结 论 　　快速干燥可以降低西瓜种子上Ac的带菌率，从而降低幼苗BFB的发病率，提高种子的健康质量，采后使种子表面干燥的时间不能超过4 h，种子发酵、采种后快速干燥、盐酸处理均可阻止病原细菌在种子表面的繁殖，将这些处理措施综合使用是防止种子带菌的有效方法。所选用的药剂和浓度，不管是药剂直接处理种子还是含药的固体基质引发处理种子，其种子质量都没有显著的差别。药剂处理的种子平均每株幼苗的鲜质量均高于含药固体基质引发处理的种子，含药固体基质引发处理对降低幼苗BFB发病率的效果比药剂直接处理种子要差。 　　参考文献 　　[1] Webb R E，Goth R W. 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