第五节 植物细胞培养
一、概念
二、植物细胞培养的方法
三、植物细胞培养的培养基
四、植物单细胞培养
五、植物细胞培养的应用
六、植物细胞的生物反应器大规模培养
七、植物细胞两相培养技术
八、植物细胞的生物反应器固定化培养
九、植物细胞培养存在的问题与发展趋势
前 言
中草药：植物细胞的大规模培养-----植物中含有数量极为可观的次代谢物
质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每
年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利
用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍的巨著《本草纲目》中所开列
的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。
然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本
上满足人类对经济植物日益增长的需求。因此早在1956年，Routier和Nickell
就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。
Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。
紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物
细胞获取了其中的薯蓣(山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。
现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分
巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20
吨）。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆
杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。
鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一
特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到
收获要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生
产这些产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养
生产的产品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。
目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛
用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规
模的培养可在发酵罐中进行。
问题
请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经济价值的产物。
抗肿瘤药物紫杉醇
薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin） 紫草宁
一、植物细胞培养的概念
1、定义：
植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体
培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增
殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。
2、意义
目前植物细胞培养已生产出过去只能从植物中提取的一系列产品，如重要药
用植物的有效成分、香料、调味品、蛋白酶抑制剂、肿瘤抑制剂以及色素等重要
产品。
与整株植物栽培相比，细胞培养技术的优点是
①代谢产物的生产是在控制条件下进行，通过选择优良细胞系和优良
培养条件等方法，得到大量的代谢产物。不受季节、地域的限制。
②细胞培养是在无菌条件下进行，因此可以排除病菌和害虫的影响。
③可以通过特定的生物转化获得均一的有效成分。
④可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。
总之，植物细胞培养，用于具有生理活性的次生代谢产物的生产方面，已成
为当代生物技术的一个重要应用技术。
二、植物细胞的培养方法
根据培养对象，植物细胞培养主要有单细胞培养、单倍体培养、原生质体培
养等。
单倍体培养 ：是指花药培养，即将花药在人工培养基上进行培养，从小孢子
直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或通过愈伤组织诱导分化出芽和根，
最终长成植株。
原生质体培养：将植物的体细胞经过纤维素酶等处理后去掉细胞壁，获得的
原生质体在无菌培养基上生长、分裂、最终长成植株。
植物细胞培养按照培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固定化培养等。
固定化培养是固体培养的一种，但不是使用固体培养基。应用最广泛的固定
化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。
细胞液体培养有静止与振荡培养两种。振荡培养需要摇床或转床等设备。
细胞悬浮培养属于液体培养的一种，是植物细胞大规模培养的主要方式，可
以通过机械或气体搅拌实现细胞的悬浮。
三、植物细胞培养的培养基
与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合
成培养基上正常生长。
用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用
于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。
根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。
（一）培养基组成
1、无机盐类：通常无机盐的浓度为25mmol/L左右。虽然硝酸盐可以单独作为无
机氮源，但是加入一点铵盐对细胞生长有利。培养基中必须添加钾元素，其浓度
一般在20mmol/L或更高一些。磷酸钙和硫元素的浓度在1-3mmol/L。
2、碳源：蔗糖或葡萄糖是常规的碳源，通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加
培养细胞的次生代谢产物量。
3、植物生长激素：大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激
素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。
4、有机氮源： 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合
物等。
5、有机酸： 加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产
物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾
盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接
种的细胞和原生质体的生长。
6、复合物质： 在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁
和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。在培养基中浓度一般是1-15
mmol/L。
目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及N6培养基
问题
1植物细胞培养基组成包括
2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？
（二）植物细胞培养基的制备
植物细胞培养基的制备是非常严格的
问题：植物细胞培养基制备时对水有哪些严格要求？
制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激
素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶
提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-
水溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至
所需体积。
配制培养基的用水应严格地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器
皿制备的蒸馏水最好。培养基的PH值应用0.5mol/L的HCL或0.2 mol/L的NaOH
进行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。
配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121oC下灭菌20min，待冷却后就可以使用。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。由于培养基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此往往把培养基配制成使用浓度的10或100倍的母液，使用时再按需要稀释至使用浓度。培养基母液或经稀释后的培养基应置于冰箱内，在10oC以下保存待用。一般含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。
在培养基配制过程中需要注意的是，为了防止在高浓度下，培养基成份间相互作用产生沉淀，诸如CaCL2、KI、EDTA的钠或亚铁盐需要单独配制保存，使用时再稀释混合。
一、 植物单细胞培养
（一）单细胞制备方法
1.机械法：是通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。该方法效率低，获得的细胞数量非常有限。
2.酶解法：选用某一专一性水解酶，将细胞壁分解掉，以释放出细胞，用来制备植物原生质体。
3.愈伤组织诱导法：该方法通过植物组织培养获得愈伤组织,由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞，也可以添加酶使细胞分离下来。
（二）单细胞培养方法
1.平板培养法：
将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养，称为平板培养法。具体步骤：
⑴单细胞悬浮液的制备，并记数。
⑵调节细胞密度
⑶培养基选择与凝固剂选择，浇平板。
⑷接种培养。
2.看护培养与饲养层培养法：
⑴看护培养:是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。
它是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。
⑵饲养层培养：是用处理过的无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。具体方法有4种：①饲养细胞与靶细胞共同混合于琼脂培养基中。②饲养细胞位于下层，靶细胞位于上层。 ③饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中。 ④双层滤纸直板培养：在饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养。
3.液体浅层静置培养: 将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。优点是易于补加新鲜培养基、易于镜检。
4.细胞悬浮培养法：是指细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下培养。其优点是：
⑴能大量提供比较均匀的细胞。
⑵细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快。
⑶适合规模培养，生产活性代谢产物。
5.微室培养法：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，也称“双层盖玻片法”。
细胞生长测定的一般方法有：
①细胞记数：在显微镜下记数，以cells/ml表示单位体积里的细胞浓度。 ②细胞体积：将细胞离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。
③细胞鲜重或干重：过滤后直接称重为鲜重，干燥后再称重是干重
(三)单细胞培养的程序
单细胞培养的程序包含建立细胞株、选择细胞株、分化培养或扩大培养、鉴定提取等四大程序。
（四）单细胞培养的技术要点
1.细胞的起始密度
起始细胞密度：指开始培养时，单位体积内的细胞数目。即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，不同的培养方式要求不同的细胞起始密度。
1悬浮培养：（0.5～2.5）×105个/ml。
2平板培养：
平板培养的效果，一般用植板率来衡量。所谓植板率即在平板上形成细胞团的百分率。
形成细胞团的数目
植板率 = ————————×100%
接种的总细胞数
3微室培养和看护培养
微室培养烟草，每微室中接种量需达到30个细胞。甘蓝×芥蓝F1花粉培养时，每微室中花粉接种量需达到50～80个，才能形成细胞团。
2.培养周期
培养周期是指具有一定起始密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程。培养周期的长短是由起始细胞密度、延长期的长短、生长速率等决定。
（五）悬浮细胞培养的同步化方法
⒈物理方法
⑴体积选择法：
将培养一段时间的细胞经过一定大小的筛选过滤，收集筛网上层的细胞；再经过较小孔径筛网过滤，收集筛网上面的细胞。选择每一孔径筛网过滤得到的细胞分别再进行培养。
⑵冷处理法：
收集细胞，在40C温度下处理数天，添加新鲜培养液培养。
⒉化学方法
⑴饥饿法：
控制培养液中营养的浓度，使细胞处于饥饿状态数天，
然后再添加营养进行
培养。
⑵抑制法：
通过向培养液中添加尿苷1ug/ml、5-氟脱氧尿苷2ug/ml等化学抑制剂抑制细胞分裂。
⑶有丝分裂抑制法：
在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水仙素处理4-6h。
（六）细胞的保存
⒈继代培养保存法
悬浮培养的细胞每隔1-2周换液进行一次继代培养；高等植物、海藻等的细胞培养一般采用这种方法。
⒉低温保存法
温度5-100C，每隔10天左右更换一次培养液。
⒊冰冻保存
⑴低温保存：
-2000C左右温度保存细胞。如紫菜叶状体阴干后可以在此温度范围内保存1-2年，仍具有成活能力。
⑵超低温保存：
如高等植物常采用液氮保存优良的细胞系。
五、植物细胞培养的应用
㈠药用代谢产物
⒈ 类：包括皂苷（人参）、强心苷、干草甜苷、香豆精苷等。
⒉ 醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、胆甾醇、异岩藻甾醇等。
⒊ 物碱：有吡啶、喹啉、异喹啉等。
⒋ 类：包括蒽醌、萘醌、返醌等。
⒌ 蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒抑制剂及抗生素 等。
紫杉醇是近年发现的重要的抗癌药物，能有效地治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科癌症。但由于紫杉醇是从珍稀植物紫杉提取的，所以如何得到充足的药物一直是医学和环境学家争论的问题。紫杉醇的生产只能通过大量的砍伐这种珍稀植物，
这显然将对环境产生不良影响。所以目前科学家们正在开展紫杉醇细胞培养法进行生产和研究。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养和生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。
紫草宁可用于创伤、烧伤以及痔疮的治疗。
人参是用于治疗与保健的名贵药材，其主要成分是人参皂苷。
植物细胞悬浮培养生产天然药物（以小檗碱为例）的方法
⑴实验材料：小檗的愈伤组织细胞，采用添加激素的普通液
体培养基。
⑵培养过程：将小檗的愈伤组织细胞悬浮培养在添加一定浓
度激素的普通液体培养基中培养，转速为
250r/min，温度250C。培养一段时间细胞浓度
增加后，进行继代培养、收获。
(3)因素分析:培养基种类、激素类、C、N种类、无机成分、
环境因素等。
㈡天然食品、食品添加剂
用植物细胞培养的方法生产的色素有胡萝卜素、叶黄素、单宁、黄酮体等。 从海藻的愈伤组织培养物中可生产琼脂；培养甜菊叶的细胞可以积累制取一种叫甜菊苷的天然甜味剂；将辣椒细胞培养可以获得辣椒素。
利用植物细胞大规模培养技术能生产多种香料物质；如培养玫瑰细胞可以获得许多酚类物质；培养洋葱细胞可以得到香料的前体物质等。
例：十蕊商陆培养生产红色素方法
⒈培养材料：十蕊商陆的悬浮细胞、含3%蔗糖的MS培养基。
⒉培养过程：
⑴将十蕊商陆的悬浮细胞培养在培养基中，在转床上振荡培养，温度280C、光照强度1500lx。
⑵逐渐收集细胞悬浮培养物。
⑶经纤维柱色谱分析测定红色素含量。
⒊结果：1g干细胞可以收获32mg红色 素粗品，物理化学性质与甜菜苷中红色素一致。
㈢杀虫剂、杀菌剂
例：从万寿菊的培养组织或细胞中可以收获农药噻吩烷；从鹰嘴豆的愈伤组织或细胞中可以得到三种鱼藤生物碱、灰叶素、鱼藤酮以及除虫菊脂等；从葫芦巴（香草）静态培养物中能分离得到蓝鱼藤酮、粉红鱼藤酮等杀虫剂；从锦葵叶愈伤组织细胞中可以收集生物碱等等。
㈣ 饲料、精细化工等产品
培养桑、蓖麻、榆等这些植物细胞，收获、混合后再配合一些附加物如大豆粉、蔗糖、淀粉等制成饲料，解决蚕饲养的饲料供给问题。
从银胶菌愈伤组织细胞中生产橡胶，方法：
⒈材料：银胶菌、添加一定浓度蔗糖的MS培养基。
⒉培养步骤：
⑴将银胶菌的叶、根、芽等按照常规方法消毒，放在愈伤组织诱导的 培养基上培养，数天后可以诱导出愈伤组织。
⑵将愈伤组织切成小块，放在新鲜培养基上继代培养，短时间内可以 获得大量的愈伤组织。
⑶测定愈伤组织的橡胶含量。
⒊结果：培养所获得的橡胶相对分子量在30000-50000之间，与整体植株 类似。
六、植物细胞的生物反应器大规模培养技术
目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。
前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。
植物细胞的大规模悬浮培养
1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量时，收获细胞，提取产物。
他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。该系统具有结构简单，易于操作等优点。问题是它的生产效率及次生物质累积的量都很低。
(一)植物细胞悬浮培养中的特性
⒈植物细胞本身的特性
植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养有很大不同，主要是：
⑴ 、植物细胞大,直径一般约为10-200μm，平均比微生物细胞大30-100倍。 ⑵ 、很少以单一细胞形式悬浮生长，而通过以细胞数在2-200之间、直径为2 ㎜左右的非均相集合细胞团的方式存在。当细胞浓度高、黏度大时容易产生混合和循环不良等问题。
⑶ 、细胞的纤维素细胞壁很容易被剪切力高的传统搅拌式微生物反应器损伤。 ⑷ 、与微生物细胞相比，植物细胞生长速度慢，操作周期长，分批培养一般 2-3周，半连续或连续培养时间一般长达2-3个月。同时植物细胞培养基成分丰富而复杂，很适合真菌等生长。因此，防止污染的发生更困难。
2. 植物细胞培养液的流变特性
植物细胞培养过程中易结团，不少细胞在培养过程中易分泌黏多糖等物质，使传氧速率降低，影响细胞生长。
3. 植物细胞培养过程中的气体传递
与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和二氧化碳的含量与传递对培养过程影响较大。
由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对细胞的生长同样相当重要。
研究发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2 ，如在空气中混以2%-4%的CO2能够消除高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。
因此，对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时， CO2和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培养时需要通入一定量的CO2等气体。
4. 泡沫和器壁表面粘附性
细胞培养过程中产生的气泡大，会覆盖有蛋白质或黏多糖，黏度也更大。细胞易被包埋在泡沫里。从循环的营养液中带出来，造成非均相培养。可以采用消泡的方法对泡沫进行消除，否则会对混合和培养的稳定性产生影响。在培养过程中，细胞会经常黏附于培养容器或反应器内一些挡板、反应器部件、电极等表面。
5. 悬浮细胞的生长与增殖
由于悬浮培养具有：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；保证氧的充分供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。
在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延迟期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的的减慢期和停止生长的静止期。整个周期时间的长短因植物种类和开始培养细胞密度的不同而不同。在细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。
6. 细胞团和愈伤组织的形成和植株的再生
悬浮培养的单个细胞在3-5天内就可以观察到细胞分裂。
如果培养的目的是为了快繁种苗，约两周后就可以将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，一般三个星期后可分化出试管苗。
如果是以生产代谢产物为目的的大规模培养，则应该采取适当手段分散开不断聚集的细胞团，使细胞保持继续增殖，达到最高细胞密度，收获目的产物。
(二) 培养过程
将新鲜的易分散的愈伤组织转移到盛有液体培养基的培养瓶中，并在摇床上进行连续振荡培养。经过若干次继代培养后，可得到均匀分散的细胞悬浮液。具体过程包括三个步骤：
1.细胞的驯化、筛选与细胞株的建立
为获得适合大规模悬浮培养和生长快的细胞系，对细胞进行驯化和筛选。 把愈伤组织接到摇瓶中液体培养，待细胞增殖后，再把它们接到琼脂培养基上。经过反复多次由固体培养转入液体培养再转入固体培养等步骤驯化、筛选得到细胞株。适合于大规模培养的细胞株应具备以下几个条件：
一要生长速度快的细胞；二要选择目的物质含量高的细胞株；三是适合悬浮培养。
具体的筛选和建立细胞株的方法
⑴愈伤组织的诱导与培养
⑵单细胞分离
⑶细胞无性系的分离：将悬浮培养物经过80μm的不锈钢网过滤除去细胞块。将细胞悬浮液浓缩后，接种于添加琼脂的培养基表面，凝固后密封，进行培养。
⑷细胞株筛选：在平板培养基中选择生长快速、疏松分散好的细胞株。再经过次生代谢物的定量测定，从中筛选出含量高的细胞株。
2.扩大培养
采用逐级增加体积的容器将优良的细胞株经过多次扩大繁殖得到大量细胞，用作生物反应器培养的种子。
3.生物反应器培养
⑴分批培养： 一次性添加培养液培养，期间不更换培养液。
⑵半连续培养：在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养
液或者添加某种营养成分。
⑶连续培养：连续地以一定速度添加培养液或营养盐，同时排
除旧的培养液，总培养液体积维持不变。
（三）植物细胞的大规模生物反应器培养
1. 生物反应器的设计与选择
设计时要考虑4因素：
⑴结构严密，能耐受蒸汽灭菌，对生物催化剂无害和耐蚀材料制作，内壁光滑无死角，内部附件尽量减少，以维持纯种培养需要。
⑵有良好的气-液接触和液-固混合性能及热量交换性能。
⑶在保证产物质量和产量前提下，尽量节省能源消耗。
⑷减少泡沫的产生，或附有消沫装置以提高装料系数。
目前，用于植物细胞悬浮培养的生物反应器有：机械搅拌式、鼓泡式和气升循环式。
机械搅拌式生物反应器优点：搅拌充分，供氧能力和混合效果都优于鼓泡式和气升循环式。但剪切力大，易对植物细胞造成较大损伤。
目前人们倾向于采用气动式生物反应器，主要包括鼓泡塔式生物反应器和气升循环式生物反应器，后者又根据结构可分为内环流和外环流两种。
2.影响植物细胞培养的因素
对于植物细胞的培养及其产物的合成，影响细胞培养的因素很多，除了细胞本身的特性外，环境等其他因素对细胞的培养也有很大影响。
（1）细胞遗传特性：
某些组织部位所具有的高含量的次生代谢物质，并不一定是该部位合成的，而有可能是其他部位组织合成后通过运输在该部位积累的。
（2）培养的环境条件：
光照 细胞生长不需要光照，光对细胞的代谢产物合成有影响。
温度 一般细胞在200C就能生长，但要获得最大生长速率，其最佳的培养温度应是26-280C。
搅拌与混合 植物细胞壁很脆，对搅拌的剪切力很敏感。在摇瓶培养时，摇瓶机振荡范围在100-150r/min。培养植物细胞，气升式反应器较常规机械搅拌罐为好。
营养盐 一是要保证植物细胞生长量的生长；二是要保证每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。
PH pH变化范围在5-6之间，最佳的起始pH在5.5-5.8之间。如果在培养基中含有酪蛋白水解物或酵母提取液等，可使培养液pH变化比较稳定。
前体 缺某种前体，细胞培养物就不能合成某一种代谢物。如紫草细胞培养加入L-苯丙氨酸使右旋紫草素产量增加三倍。
调节因子 生长调节剂的种类或数量会影响细胞的生长与分化，而且对次生代谢产物的合成起重要作用。
植物细胞生长和产物合成动力学也可分三种类型：
生长偶联型 产物的合成与细胞的生长呈正比；
中间型 产物仅在细胞生长下降时才能合成，细胞处于指数生长期时，次 级产物含量下降，但细胞生长停止时，产物合成也停止；
非生长偶联型 产物只有在细胞生长停止时才能合成。
值得注意的是: 影响植物细胞培养物的生物量增长和次生代谢物积累的因素是错综复杂的，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化，所以，需要在培养过程中不断加以平衡和研究。
同时，由于不同的植物有机体有其本身的特殊性，因此，对于一种植物或一种次生代谢物合适的条件，不一定对其他的细胞或次生代谢作用也是合适的。目
前，对植物细胞大量培养一般分成两个阶段：第一阶段是利用生长培养基，尽可能快地使细胞的生物量得到增长；第二阶段是通过生产培养基来诱发和保持次生
3.培养方法
在大规模植物细胞悬浮培养中，为了提高生物量和次生代谢产物量，一般采用二阶段培养工艺。
第一阶段尽可能快地使细胞量增长。
第二阶段诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应的代谢产物。
因此,在细胞培养周期中，通常要更换不同品种和浓度的植物生长激素和凝胶体的液体培养基。
（四）植物细胞的生物反应器高密度培养
1.气升环流式生物反应器培养紫草细胞
（1）细胞与培养基
紫草细胞来自于紫草叶诱导的愈伤组织，经多次培养筛选获得。细胞生长培养基为修改后的B5培养基，添加IAA、KT（激动素）等微量成分。细胞色素生产培养基为添加IAA和KT等成分的M9培养基。
（2）两步法培养过程
第一步：将作为种子紫草细胞，接种于7L的液体培养基的反应
器，培养14天。
第二步：放出培养液。然后加入7L紫草色素积累的培养液，培
养20天。培养中监测酸碱度变化以及紫草细胞浓度和
色素含量变化。
2.搅拌式生物反应器悬浮培养水母雪莲细胞
水母雪莲是我国传统的中草药，有生物碱、黄铜等成分
（1）植物细胞与培养基
选用水母雪莲愈伤组织红色系。
培养基采用添加萘乙酸、6-苄基嘌呤蔗糖、葡萄糖等成分的MS培养基。
（2）培养过程
将约3g的水母雪莲愈伤组织接种于含液体MS培养基的三角瓶中，250C、摇床转速100r/min，每10天传代一次。
定时进行细胞鲜重、干重、存活率、可溶性糖、聚集体分布、总黄酮等的分析测定。
（五）植物细胞的生物反应器培养存在的主要问题
植物细胞培养在放大过程中往往产量会比实验室摇瓶培养或小型反应器培养下降许多，次生代谢产物合成能力也会降低许多，主要原因可能是以下因素造成：
⒈通气和搅拌引起的流体压力对细胞或积聚体造成细胞损伤、有益气体的散失、大量泡沫的生成等，这些均会对细胞生长和产物积累产生影响。
⒉高密度引起培养液黏度增加，造成细胞对营养、气体传递的抑制。 ⒊反应器结构缺陷因素，如死角等部位细胞黏附引起的细胞死亡、腐败、营养和气体吸收限制等，搅拌桨类型缺陷或通气方式等。
⒋对产物相关积累的机制、途径等（尤其是营养与环境条件）尚不是非常清楚，因此很难维持最佳培养条件。
七、植物细胞两相培养技术
两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后转移至有机相中。
优点是:一是减少产物的反馈抑制，提高产物含量，二是通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化。
建立植物细胞的两相培养系统必须满足以下条件：
⒈添加的有机物或多聚化合物对植物细胞无毒。
⒉产物易被有机物吸附或溶解于有机相中。
⒊两相之间的分离容易。
⒋有机物或多聚化合物不能吸收培养基中的有效成分。
植物细胞两相培养具体过程(以紫杉醇为例)
⑴ 实验材料：
细胞株系为东北红豆杉细胞系，培养基采用某些成分加倍后的B5培养基，附加蔗糖、水解酪蛋白等成分。有机溶剂采用与细胞相容、对产物有大的分配系数的十六烷、油酸等。
⑵ 生产过程与紫杉醇含量分析：
将红豆杉细胞两相培养在250C、100r/min的摇床上，无光照。培养10天后补加营养盐，再继续培养6天。离心分离获得细胞，对于收获的细胞经冻溶、加入环己烷研磨破壁，再加入甲醇超声处理，合并甲醇用于测定。
⑶结果：
两相培养结果优于一般悬浮培养，胞内紫杉醇含量0.89mg/L，胞外培养液中含量为0.75 mg/L，有机相中含量为10.65 mg/L，总产量为12.39 mg/L。
八、植物细胞的生物反应器固定化培
(一)植物细胞固定化定义
细胞固定化是将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的支持物内 部或贴附在它的表面、培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。
植物细胞固定化培养具有以下优势：
⒈ 细胞生长较为缓慢，利于次生代谢产物的积累。
⒉ 于控制化学环境、收获次生代谢产物。
3.细胞经包埋后使所受的剪切力损伤减小。
⒋有利于进行连续培养和生物转化。
(二)植物细胞固定化方法
1.包埋法
（1）海藻酸盐固定化
海藻酸盐是一种由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成的多糖，在钙离子等多价阳离子的存在下，糖中的羧基和阳离子之间形成离子键，从而形成胶体溶液。
具体步骤： 配置一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。将离心收集的植物细胞悬浮液与海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，然后慢慢滴入到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，形成球形颗粒。过滤收集颗粒，用
含有的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。
海藻酸盐固定化培养细胞举例
针对细胞悬浮培养的缺点，Brodelius等（1979）首次报道了用海藻酸 钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。
细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。
此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细
（2） 卡拉胶固定化
与海藻酸盐固定化不同的是卡拉胶必须加热保持液态。主要有三种方法 ⑴ 入法：
用含NaCl的热溶液配制卡拉胶溶液，高温、高压灭菌，将植物细胞悬浮液与卡拉胶溶液混合，滴入含KCl的培养基中，形成颗粒后过滤收集，经过清洗
后转入合适的培养基中培养。
⑵ 铸法：
将细胞-卡拉胶的悬浮溶液注入由两块夹子夹紧构成的模子中形成颗粒。该法仅适合制备少量的固定化细胞。
（3）两相法：
将细胞-卡拉胶的悬浮溶液在不断搅拌的情况下分散于豆油等有机相中，形成大小、形状都比较均匀的颗粒。
（3） 琼脂糖固定化
优点是不需要其他离子来保证胶的稳定性。主要方法是：
⑴ 块法：
将细胞悬浮于经过灭菌处理的琼脂糖中，不断搅拌，待混合物凝结后，将包埋有细胞的琼脂糖凝块挤进无菌的金属网中，使其分散成小颗粒。清洗颗粒后转入适当的培养基中进行培养。该法简单，但制得的颗粒较大、形状不规则，只适宜分批培养。
（2）模铸法：步骤与卡拉胶模铸法固定化基本相同。
（3）两相法：
在搅拌下将细胞-琼脂糖溶液分散于无菌的豆油中，形成液滴后置于冰浴中冷却并不断搅拌，使其凝固，离心去除油相和大部分溶液，直至无油为止。
（4） 琼脂固定化 方法同琼脂糖固定化
（5） 膜固定化
各种膜状结构的物质（如乙酸纤维、聚乙烯等）可以用来固定化细胞。 如乙酸纤维碳酸硅在反应器内集成平行束，当悬浮液中的细胞与这些纤维束混合时，细胞可通过物理束缚或基质材料的吸附作用被固定。纤维膜具有渗透性，培养液中的营养物质可通过纤维膜渗透到反应器内细胞中。
这种植物细胞固定化方法简单，纤维膜通过清洗还可再次利用，因此是近年来使用较广泛的一种固定化方法
2.吸附法
很多细胞都有吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力。供植物细胞吸附用的载体多为多孔性惰性物质材料，如聚氨酯泡沫、尼龙网、中空纤维、生物膜等。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附是使用具有高度吸附能力的吸附剂将细胞吸附到载体表面上使之固定化。所用载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
离子吸附法是靠细胞在游离状态下所具有的静电引力（离子键合作用）而固着在带有相异电荷的离子交换剂上的方法[如二乙氨基乙基（DEAE）-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、羧甲基（CM）纤维素]。
总之，人类迄今通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类，其中已有30多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。
在已研究过的200多种植物细胞培养物中，已发现可产生300余种对人类有用的成份，其中不乏临床上广为应用的重要药物。
利用培养植物细胞工厂化生产生物天然次级代谢产物的美好前景已经十分清楚地展现在我们面前。深入发掘我国特有的巨大中草药宝库，结合现代细胞培养技术，我国植物细胞次生物质的研制与生产一定会硕果累累，后来居上。
(三) 固定化细胞的活力测定
⒈染色法
二乙酸荧光素（FDA）染料能被活细胞吸收、酶解脱去乙酰基而使这种染料产生荧光，死亡的细胞没有这种现象。
⒉呼吸强度测定
用氧电极法测定细胞的呼吸作用来表示细胞的存活率。
3.细胞生长速率的测定
细胞数量或重量的增加可以作为细胞活性的良好指标。
(四) 植物细胞固定化生物反应器培养
适合于植物细胞固定化培养的生物反应器系统主要有：
流化床生物反应器：
流化床生物反应器中，细胞包裹在胶粒或泡沫颗粒中，细胞包埋的颗粒小，
传质效率高。
缺点是剪切力或碰撞会破坏固定化的细胞。
填充床生物反应器：
填充床生物反应器中，细胞固定在胶粒或泡沫颗粒，也可以位于支持物的表面，细胞固定不动，通过流动的培养液实现混合和传质。
优点是：单位体积容量大
缺点是：混合效率低、固定床颗粒或支持物碎片会阻塞液体的流动、固定的材料在高压下容易变形，导致固定床的阻塞。
膜生物反应器：
最常用的是中空纤维膜生物反应器,这种反应器传质效率低、易阻塞，产物收获较困难，而且反应器投资大。
反应器共同特点是:细胞固定而培养液循环流动。
不同点是:反应器的外观形式、细胞固定化方式和液体流动方式有所差异。
膜生物反应器
在植物细胞培养过程中，主要采用的是中空纤维和螺线式卷绕反应器。如图所示。膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。
另外，
由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。
九、 植物细胞培养存在的问题与发展趋势
⒈技术问题：
首先，植物细胞具有高度易碎性、对剪切力敏感。
其次，植物细胞在悬浮液中生长缓慢，
第三，细胞易聚集成一些大团块，分化成形态不同的片层。同时培养的细胞易产生变异。
第四, 植物细胞生物反应器放大培养的问题尚未解决。
2.经济问题：
植物细胞培养存在成本过高的缺陷，必须从产品的高附加值得到回报。
3.趋势：
①高效细胞系的筛选②发展大规模细胞培养所用的培养基③开发出适合植物细胞大规模培养的生物反应器系统④两相培养、固定化培养技术发展前景广阔⑤对细胞分化、次生代谢产物和培养条件之间的关系等进行基础研究。