微生物学大实验
实验指导
编者：
生物技术教研室
2007.3
目录
实验一 酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二 酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三 酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四 酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五 耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六 酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵 ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究
实验一 酵母菌的培养与分离
一、实验目的
学习培养和分离酵母菌的技术和方法
二、基本原理
大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。
三、实验主要内容和要求
（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：
1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。
2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。
3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。
4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。
四、实验的准备
1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法：
（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。
（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。
（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。
五、实验设计
l、接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊。
2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28一30℃再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。
3、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。 活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。
4、分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落。挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。
六、实验注意事项
1.配制培养基时，应注意琼脂的加量，不同规格及批次的琼脂的加量应由实验确定，不能照搬书上的加量。
2.对培养基加热时应注意琼脂的糊底与暴沸。
3.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。
4.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。
七、实验结果的观察及记录
1.24小时，观察试管内培养液的情况并作记录，每组转接2支试管。
2.48小时，观察试管内培养液的情况，镜检培养液内菌的数量，粗略判断是否为酵母菌并作记录，每人蘸取培养液进行划线分离，并作记录。
3.72小时后，观察培养皿内菌的生长的情况，挑取单个菌落进一步划线分离，直到为纯菌落。
4.每组转接10支斜面试管，备用。
八、实验的延伸
自然条件下酿造苹果酒，葡萄酒、猕猴桃酒。
七实验报告要求
1.实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。
2.实验报告内容包括：
（1）立题意义。
（2）实验设计。
（3）实验步骤详细记录。
（4）对实验结果的分析讨论和总结。
（5）实验延伸。
（6）实验心得体会。
附1：果酒的酿制方法
—、目的要求
了解果酒酿制原理，学习苹果酒酿制技术。
二、基本原理
果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。
各种果酒以原料而称名。除坚果外，所有栽培果，野生果均可做酿果酒的原料。本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。
三、实验材料
1、菌种 在7°Be’麦芽汁琼脂斜面培养基上的葡萄酒酵母（s.cerevisae ellipsoieleus）。
2、器材 苹果汁培养基，7°Be’麦芽汁培养基，10ml／管、100ml／三角瓶等装量，白糖，食用酒精，亚硫酸，果胶酶，发酵缸，破碎机，果汁分离器等。
a.苹果汁培养基
粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13°Be，酸度0.5%以下）1000ml
K2HPO4 0.1g MgSO4·7H2O 0.1g
配好后，加热煮沸3～5分钟，静置10小时以上，过滤、分装，0.7Kg／cm2灭菌20分钟。
四、实验步骤
（一）酒母培养
1、菌种活化（一级种） 取装有10ml苹果汁或7°Be’麦芽汁培养基1支，按无
菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环，混匀后置28～30℃下培养2～5天（用苹果汁活化菌种时需培养5天以上），镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。
2、母发酵剂制备（二级种） 在装有100ml苹果汁培养基的三角瓶中，接1～2ml经活化的葡萄酒酵母菌液，于28℃下培养2～3天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。
3、生产发酵剂的制备（三级种） 方法与母发酵剂相同，只是采取更大的容器。一般采用500～1000ml的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1／2～3／5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10％接种量接人母发酵剂，在25～28℃下培养24～48小时，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。
4、如果使用活性干酵母，添加量为20g/L发酵醪，复水用水量是干酵母重量的5～10倍。复水用水的温度应保持在40℃左右（38～43℃），将酵母静置5～10min后搅拌，酵母在水中的时间不能超过30min。然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪的温差小于10℃，然后直接加入发酵醪。
（二）果酒生产
工艺流程如下：
果胶酶
↓
苹果→分选除杂下清洗→破碎→压榨→粗果汁→果楂、苹果酸、丹宁
↑
活化酵母→母发酵剂→生产发酵剂
↓
蔗糖→发酵→皮渣分离→后发酵→原酒→
→ 换捅除渣→贮存陈酿→配制→贮存→澄清过滤→装瓶→巴氏灭菌→封口→成品。(2～3次)
操作要点：
1、分选 取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。
2、清洗 清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。
3、破碎 为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。用破碎机破碎至果块粒度0．5cm3左右，并除去果籽。
4、压榨分离 破碎后立即进行压榨分离。分离出的果汁中不得夹带果肉，同时需添加适量苹果酸调整含量（要求果汁总酸含量为5g／L），并加入0.1～0.15g／L的果胶酶，促进果胶分解，使果汁澄清并提高酒的风味。
由于苹果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化，故需加SO2还原剂抑制酶活性，同时
SO2也具有杀菌、防腐和澄清果汁作用。SO2来源，除工厂应用液态SO2外，实验室常加
入亚硫酸钠（Na2SO3）和偏重亚硫酸钾（K2S2O5），其用量为果汁量的0.02％即可。
5、前发酵 取澄清果汁放入经干热灭菌的发酵缸中，装量占缸容积的4／5，按3～5％的接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在18～22℃之间，最高勿超过25℃，发酵应在7～12天内结束。一般苹果汁糖分约为11％，经发酵后，酒精含量约达6％以上，前发酵结束后，原酒酒度应大于8％（V），残糖＜20g／L，总酸（苹果酸）＞5g／L。
6、后发酵 前发酵结束后，迅速将酒液与皮渣分离，酒汁转入经干热灭菌的发酵缸中，进行后发酵，使残糖继续分解。期间，控制品温在18～22℃之间，不要超过25℃，时间1个月，即得原酒。要求残糖含量小于2g／L以下，挥发酸（以醋酸计）小于0.6g／L，总酸（以苹果酸计）大于5g／L。
7、换桶除渣 为使已澄清的原酒与其酒脚（沉淀物）及时分离，以免酒脚产生异味而影响酒质，故需进行换桶（缸）。换桶次数新酒每年换三次。
8、贮存陈酿 应满桶贮存。陈酿即酒的老熟，经长期密闭贮存，可使酒质澄清、风味醇厚。贮存室温8～16℃，存期半年以上。
9、配制 原酒贮存半年后可开始配制。配制时，按工艺规定将不同原酒按一定配比相混，然后添加适量的糖、酒精、继续贮存半年以上。
10、澄清过滤 可采用冷冻法使其澄清，即于-4℃左右存放7天，然后冷过滤。澄清后的酒置-5～-7℃下冷冻3天不发生混浊沉淀，或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格。
11、装瓶灭菌 装瓶后需进行巴氏灭菌，即在63℃下处理15分钟，冷却后封口保存。
五、实验报告
1、简述苹果酒的酿制法。
2、二氧化硫在果酒酿制中的作用是什么？
六、思考题
1、酵母菌酿酒的原理是什么？
2、果酒酿制中为何要加入果胶酶？
实验二 酵母菌的鉴定
酒精生产中所用酵母菌在微生物学中的分类依据是什么?
微生物学的类别分门、纲、目、科、属、种，生产酒精用酵母菌属于微生物中的真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。酵母菌的分类依据是根据它的形态特征、生理生化反应特征来确定的。在分类前将菌体细胞进行分离纯化，得到由单细胞长成的菌落，然后再进行形态特征和生理生化鉴定。
(一)形态特征的鉴定
把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上，让它长成菌落，观察其菌落的形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。把它再接种到液体麦芽汁培养基中，观察是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环，培养液中是否产生沉淀、混浊程度等。另外，还要取样在显微镜下观察其单细胞的形态、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。
(二)生理生化特征的鉴定
酵母菌的生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类的能力。同时，还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸盐还是硫酸盐，发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等的能力。
最后，根据以上得出的形态特征和生理生化特征，查阅有关资料，把具有相同特征的一类酵母菌，就可以归属于某一属。
怎样鉴定酵母菌在液体培养基中的培养特征?
将酵母菌种接种于米曲汁或麦芽汁液体培养基中，放于恒温培养箱内以28—30℃保温培养18—24、24—48、48—72小时，取出观察各个时期液体培养基表面有无白色浮膜物-醭的存在，各个不同时期培养基中有无沉淀或沉淀的多少、有无混浊和混浊程度、试管或其它培养器壁上有无菌环形成，最后取出各个不同时期的样液，注入酵母细胞计数器--血球计中，放置显微镜下观察单个细胞的形态变化情况、液泡的大小、细胞数增加的多少以及培养基中pH值的变化情况等，并测定其酒精和二氧化碳的生产量。然后根据不同的反应情况，作好详细的原始记录，便于以后培养菌种时比较和参考。 酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验
（一）实验目的
了解鉴别酵母菌的实验方法。
（二）实验原理
酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。
酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（pH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。产气可由发酵管气泡的产生予以证实。
（三）材料
糖发酵基础液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。
（四）实验内容
1、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中（培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4×2.0－2.5厘米）一支。每种糖设三个重复管，高压灭菌15分钟。
2、将酵母分别接入上述各发酵管中，置下培养48-72小时，另以不接种者作对照
3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。
4、结果记录。以“ ”表示产酸，“表示产气，“＋”表示产酸产气，“－”表示无变化，“碱”表示产碱。
二、酵母菌碳源同化试验
（一）实验目的
了解酵母菌对各种碳源的利用情况。
（二）实验原理
碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活动提供所需的能量和组成其结构的物质。酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。
（三）材料
无碳基础培养基，啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖溶液。
（四）实验内容
1、液体试管法
（1）每管加无碳基础培养基5毫升，加被测试的某种碳源，并以葡萄糖作为对照。
（2）接入啤酒酵母，下培养1-2周，观察结果。
2、生长图谱法
（1）无碳培养基内加入2%的水洗琼脂，融化后冷却至45，到至平板。
（2）接种新鲜培养的啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未凝平板内，摇匀待凝。
（3）皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源的标记。
（4）用不锈钢匙，按标记加入相应的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作对照。
（5）下培养24-48小时后观察结果。
3、结果观察
（1）液体试管中是否形成醭，环岛等。
（2）生长图谱中测量菌落大小，说明对碳源的利用情况。
三、酵母菌氮源同化试验
（一）实验目的
了解酵母菌对各种氮源的利用情况。
（二）实验原理
酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂的蛋白质不能利用，酵母菌对一些较简单的含氮化合物的利用程度也不一致。
（三）材料
无氮基础培养基，啤酒酵母斜面菌，0.5%的蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素溶液。
（四）实验内容
1、液体试管法
方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。
2、生长图谱法
方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白对照。
3、结果观察
（1）液体试管中溶液pH值的变化。
（2）生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。
四、酵母菌生长曲线的测定试验
（一）实验目的
掌握单细胞微生物群体生长曲线的几种测定方法。
（二）实验原理
酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。在其生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。此生长曲线大致可划分为四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期和衰退期。 （三）材料
酵母菌增殖培养基，苹果酒酵母斜面菌种。 （四）实验内容
1、将培养24小时左右的酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以3000转/分的速率离心，得菌体。将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2-3次后，制备酵母菌悬液（细胞数量约106左右/毫升），测数备用。
2、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，下培养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。并在培养1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量。 3、酵母菌细胞数量的检测
方法①：活菌计数法。此法是将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，取一定量体积（在0.1-1毫升之间）的稀释液涂布于盛有固体培养基的培养皿内，在下培养24小时左右，计算培养皿内菌落数就可测出溶液中活菌数量。
方法②：血球计数板计数法。此法是先将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，使菌落数约为105-106个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在显微镜下直接计算细胞总数。 4、绘制生长曲线
以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌的生长曲线。并分析酵母菌群体的生长规律。
五、实验结果的观察及记录（见表1－2） 六、思考题
1. 为什么碘液反映无色糖化即可结束？ 2. 煮沸强度对麦芽汁质量有什么影响？
11
附1麦芽汁培养基的制备：
麦芽汁制备俗称糖化。所谓糖化是指将麦芽和辅料中高分子贮藏物质（如蛋白质、淀粉、半纤维素等机器分解中间产物）通过麦芽中各种水解酶类（或外加酶制剂）作用降解为低分子物质并溶于水的过程。溶解于水的各种干物质称为浸出物，糖化后未经过滤的料液称为糖化醪，过滤后的清夜称为麦芽汁，麦芽汁中浸出物含量和原料干物质之比（质量分数）称为无水浸出率。 方法一
（1）取50g麦芽，在EBC标准磨上粉碎；
（2）将已经粉碎好的麦芽粉放入已称重的糖化杯中，加200mL46℃水，不断搅拌并在46℃水浴中保温30min；
（3）使醪液以1℃/ min速率升温到70℃。此时杯内加入100mL70℃水，保持恒温。 （4）5min后用玻璃棒取麦芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后观察碘液颜色变化。直到碘液呈纯黄色不再变色，停止保温，糖化结束。 （5）在10~15min内急剧冷却到室温；
（6）冲洗搅玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g； （7）用玻璃棒搅拌糖化杯，并注于漏斗中进行过滤，即获得麦芽汁。 方法二
称取市售麦芽粉或大麦经浸泡、发芽、干燥、粉碎的麦芽粉，按每Kg麦芽粉加入60—65℃温热水3.5—4kg。于55—60℃保温糖化3-4小时，用碘液检查，然后4层纱布过滤，过滤液中加鸡蛋白加水20 mL，调匀之生出丰富的泡沫为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后用4层纱布过滤，即得到澄清、透明的麦芽汁，灭菌后方可备用。
附2 酵母菌鉴定常用培养基 1.酵母菌生孢培养基 （1）麦氏琼脂
葡萄糖 1g KCL 1.8g 酵母浸膏 2.5g 醋酸钠 8.2g 琼脂 12g 蒸馏水 1000ml
115℃灭菌20min （2）胡萝卜培养基
将葫萝卜切成的6~7cm的长条，下后上薄，装入培养管中，加水1ml，杀菌，即成。 （3）Gorodkowa氏培养基 消化蛋白 1g 葡萄糖 0.1g 氯化钠 0.5g 琼脂 1.2g 水 100ml 2.12.5％豆芽汁培养基
黄豆芽125g加1L，煮沸半小时，过滤后补足水至1L。115℃灭菌30min 3.0.6％酵母浸汁
加60g干酵母粉于1L水中，必要时加入一些蛋清以澄清滤液，121℃灭菌15min，趁热用双层滤纸过滤；115℃灭菌15min。 4.同化碳源基础培养基
(NH4)2SO40.5%,KH2PO40.1％，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02％，水洗琼脂2％。115℃灭菌15min
同化碳源液体培养基
(NH4)2SO40.5%,KH2PO4,MgSO4-7H2O0.05%,CaCl2-2H2O0.01%.NaCl0.01%,酵母膏0.02％，糖或其它碳源0.5％。
用蒸馏水配，培养基过滤后分装小试管，每管3 ml, 115℃灭菌20min。 5. 同化氮源基础培养基
葡萄糖2％，KH2PO40.1％，MgSO4-7H2O0.05%,酵母膏0.02％，水洗琼脂2％。 用蒸馏水配，培养基过滤后分装大试管，每管20 ml, 115℃灭菌15min。
附3酵母各属检索表
(一) 1.生子囊孢子(简称孢子)，营养细胞芽殖(二)。 2. 生子囊孢子，营养细胞裂殖或兼有芽殖(三)。
3.不生子囊孢子，但生掷孢子营养细胞芽殖(四) 4.不生子囊孢子及掷孢子(五) (二) 营养细胞芽殖，生子囊孢子
1.除芽生细胞外，有真菌丝„„„„„„„„„„„„„„（1）拟内孢霉属（Endomycopsis）。 2.无真菌丝
（1）营养细胞多边芽殖（A） （2）营养细胞两极芽殖（B）
（A）1.孢子圆卵形，光面，无凸线（Ⅰ） 2. 孢子半圆形，光面，无凸线（Ⅱ） 3. 孢子痣面（Ⅲ） 4. 孢子有凸线（Ⅳ） 5. 孢子长条形（Ⅴ）
6.生袋状子囊，孢子多到16个，圆形„„„„„„„„„（2）油脂酵母属（Lipomyces）（Ⅰ）1. 孢子1～4个，圆，卵形，光面，无凸线；营养细胞多边芽殖，圆形，卵形，长形。
„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„（3）酵母菌属（Saccharomyces）
（a）孢子生成时，子囊有二营养细胞结合而成。„„„结合酵母亚属（Zygosaccharomyces） （b）孢子生成时，子囊生试探接合枝，但无二细胞结合现象„孢子圆酵母亚属(Torulaspora)
（c）孢子生成时，子囊直接有营养细胞变成，无试探枝及结合现象„„„„„酵母菌亚属（Saccharomyces）
2.孢子1～4个，光面，无凸线；圆卵形，但营养细胞两极芽殖，为柠檬形„„„„„„„„„„„„„„„„„„（4）类酵母属(Saccharomycodes) （Ⅱ）孢子为半圆形或肾形
1. 孢子为半圆形，多角形，或兼有圆形的„„„„„„„„„„（5）毕氏酵母属(Pichia) （a）孢子生成时，子囊有二营养细胞结合而成。„„„接合毕氏酵母亚属（Zygopichia） （b）孢子生成时，子囊有营养细胞直接变成„„„„„„„„„毕氏酵母亚属(Pichia)
2. 孢子为肾形„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
（a）孢子生成时，子囊有二营养细胞结合而成。„„接合肾孢酵母亚属（Zygofabospora） （b）孢子生成时，子囊有营养细胞直接变成„„„„„„肾孢酵母亚属(Fabospora) （Ⅲ）孢子痣面
1. 孢子痣面，无凸线；营养细胞多边芽殖„„（7）德巴利酵母属(Debaryomyces) 2. 孢子痣面，无凸线，子囊由接合子的芽子而成，营养细胞两极芽殖„„（8）纳酵母属(Nadsonia)
3.孢子痣面，圆或卵形，中腰有凸线；营养细胞多边芽殖，„„„„（9施氏酵母属(Schwanniomyces) （Ⅳ）孢子有凸线
1. .孢子痣面，圆或卵形，中腰有凸线„„„„„„„„„„„„„„„„施氏酵母属 2. .孢子光面，圆或卵形，中腰有凸线，使整个形体如土星状„„„（10）魏氏酵母属(Williopsis)
（a）孢子生成时，子囊有二营养细胞结合而成„„„„„„接合魏氏酵母亚属（Zygowilliopsis）
（b）孢子生成时，子囊直接由营养细胞变成„„„„„„„魏氏酵母亚属（Williopsis） 3. 孢子光面，凸线生在一边，使孢子形如草帽，营养细胞多边芽殖„„（11）汉氏酵母属(Hansenula)
（a）孢子生成时，子囊有二营养细胞结合而成„„接合汉氏酵母亚属（Zygohansenula） （b）孢子生成时，子囊直接由营养细胞直接生成„„„汉氏酵母亚属(Hansenula)
4. 孢子光面，凸线生于一边，使孢子形如草帽，营养细胞两极芽殖，„„„„„„ „„„„„„„„„„„„„„„„„„„（12）孢子柠檬形酵母属(Hanseniaspora) （Ⅴ）孢子长条，梭形或鞭形。
1. 一个子囊中只有一个孢子„„„„„„„„„„（13）单孢酵母属(Monosporellu) 2. 孢子2～8个，长条带鞭毛，如鞭子„„„„„„„„（14）鞭子酵母属(Nematospora)
3.孢子无鞭毛„„„„„„„„„„„„„„„„„„（15）蝇肠酵母属(Coccidiasous) （B）营养细胞，两极芽殖，柠檬形。
1. 孢子生成时，营养细胞直接变成子囊„„„„„„„（4）类酵母属(Saccharomycodes) 2. 孢子上有凸线，使之成草帽形„„„„„„（12）孢子柠檬形酵母属(Hanseniaspora) 3. 孢子痣面，子囊由接合子的芽子而成„„„„„„„„„„（8）纳酵母属(Nadsonia) （三）营养细胞裂殖，或兼及芽殖，生子囊孢子。 1.由真菌丝（Ⅱ）
2.假菌丝发达（Ⅱ）无真菌丝（Ⅰ） （Ⅰ）只有裂生子，无真菌丝。
1. 孢子圆形卵形„„„„„„„„„„„„„（16）裂殖酵母属(Schizosaccharamyces) 2. 孢子肾形„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„（17）北港酵母属 （Ⅱ）有真菌丝
1. 有真菌丝，只裂殖生裂生子„„„„„„„„„„„„„„（18）内孢霉(endomyces) 2.有真菌丝，芽殖兼及裂殖„„„„„„„„„„„„（1）拟内孢霉属（Endomycopsis）。 （四）生掷孢子
1. 掷孢子肾形，不对称，菌落红色或红„„„„„„（19）掷孢酵母属(Sporobolomyces) 2. 掷孢子圆形或卵圆形，菌落无色或浅黄色„„„„„„„（20）布尔酵母属（Bullera）。 （五）不生子囊孢子或掷孢子
1. 芽殖细胞及假菌丝外生真菌丝且分裂生裂生子„„（21）芽裂酵母属(Trichosporon) 2. 芽殖细胞，假菌丝及真菌丝可能有，但无裂生子（Ⅰ）。
（Ⅰ）1. 普通假菌丝甚发达，真菌丝可能有„„„„„„„„„（22）假丝酵母属(Candida) 2. 无真菌丝，假菌丝原始型或无（Ⅱ）。
（Ⅱ）1. 生类胡萝卜素„„„„„„„„„„„„（23）红酵母属(Rhodotorrula) 2. 无类胡萝卜素（Ⅲ）。
（Ⅲ）1. 两极芽殖，普通细胞常为柠檬形„„„„„„„（24）无孢柠檬形酵母属(Kloeckera) 2. 三角芽殖，营养细胞常为三角形„„„„„„„„„（25）三角酵母属(Trigonopsis) 3.营养细胞瓶形，芽殖，子母细胞基部甚宽，生横膜„„（26）瓶形酵母属(Pityrosporum)
4. 营养细胞一端为尖穹窿状，含糖培养基中生大量的酸„„„„（27）瓶形酵母属(Brettanomyces)
5. 营养细胞圆形或卵圆形（Ⅳ）。
（Ⅳ）1. 生荚膜及淀粉样物质，不发酵„„„„„„„„„（28）隐球酵母属(Cryptococcus)。 2. 无淀粉样„„„„„„„„„„„„„„„„„„（29）圆酵母属(Torulopsis)。
酵母菌亚属各种检索表
（Ⅰ）1. 只发酵葡萄糖（包括果糖及甘露糖）及半乳糖：
（a）细胞圆形，子囊孢子一个，„„„„„„„„„„„„„单孢子酵母（S.unisporus）
（b）细胞圆形，子囊孢子2或多个„„„„„„„„„„„„大连酵母 (S.dairens) （c）细胞卵形„„„„„„„„„„„„„„„„„„球形酵母（S.globosus）。 （Ⅱ）1. 只发酵葡萄糖、半乳糖及蔗糖„„„„„„„„„„„„S.ribis
2. 发酵糖类不同（Ⅲ）。
（Ⅲ）1. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及棉子糖：
（a）同化麦芽糖„„„„„„„„„„„„„„„„„水果酵母（S.fructuum）
（b）不同化麦芽糖„„„„„„„„„„„„„„„„„少孢酵母 (S.exiguus) 2. 发酵糖类不同（Ⅳ）
（Ⅳ）1. 只发酵葡萄糖、半乳糖及麦芽糖„„„„„„„„„„„„意大利酵母(S. italicus)
2. 发酵糖类不同（Ⅴ）。
（Ⅴ）1. 只发酵葡萄糖、蔗糖及麦芽糖„„„„„„„„„„„„异质酵母(S. heterogenicus)
2. 发酵糖类不同（Ⅵ）。
（Ⅵ）1. 只发酵葡萄糖、蔗糖及棉子糖„„„„„„„„„„„„舍氏酵母(S. chevalieri)
2. 发酵糖类不同（Ⅶ）。
（Ⅶ）1. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖及麦芽糖„„„„„„„„„士泰因酵母(S. Steineri)
2. 发酵糖类不同（Ⅷ）。
（Ⅷ）1. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖及蜜二糖„„„„微球酵母(S. microellipsodes)
2. 发酵糖类不同（Ⅸ）。
（Ⅸ）1. 只发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及棉子糖：
（a）细胞圆形„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„卵形酵母（S.oviformis） （b）细胞卵到长形„„„„„„„„„„„„„„„„„„白氏酵母 (S.bayanus) 。 2. 发酵糖类不同（Ⅹ）。
(Ⅹ) 1. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖及棉子糖：
（a）细胞圆形及卵形„„„„„„„„„„„„„„„„„„„酿酒酵母（S.cervisiae） （b）细胞长卵及长形„„„„„„„„„„„„„„„„„韦尔酵母 (S.willianus) 。 2. 发酵糖类不同（Ⅺ）。
(Ⅺ) 1. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖及蜜二糖：
（a）细胞圆及卵形„„„„„„„„„„„„„„„卡尔斯伯酵母（S.carlsbergensis） （b）细胞长卵形„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„娄哥酵母 (S.logos) 。 （c）细胞长卵形及发达的假菌丝„„„„„„„„„„„„果汁酵母 (S.uvarum) 。 2. 发酵糖类不同（Ⅻ）。
(Ⅻ)1. 只发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖及蜜二糖„„„„„„巴氏酵母 (S.pastorianus)
2. 只发酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖及棉子糖„„„„„„„„乳糖酵母 (S.lactis) 。
实验三 酵母菌耐受能力的测定
一、酵母菌耐高温能力的测定 （一）实验目的
了解酵母耐高温试验的原理及应用。 学习酵母菌耐高温试验的操作技术。 （二）实验原理
酵母生殖，需要一定的温度，温度过低或过高，均不生长，生殖率最大的温度，称为最适温度；一般的酵母，在35℃以上，生殖困难，发酵力弱。 （三）实验材料 （1）菌种 酿酒酵母 （2）培养基 10Bx麦芽汁
（3）其它 发酵瓶，吸管，接种针，培养箱等。 （四）方法与步骤
配制酵母培养液15瓶，10％的接种量接入酵母菌，加拴，抹干，称量。按标签各置
32℃，35℃，38℃，40℃，42℃保温箱中。每个处理3瓶。每天称量一次，并观察发酵情况，5天为止。计算总减轻量，以定温度过高之害及最高发酵温度。 （五）实验结果见表3
表3酵母耐高温测定结果
二、酵母菌耐酒精能力的测定 （一）实验目的
了解酵母耐酒精试验的原理及应用。 学习酵母菌耐酒精试验的操作技术。 （二）实验原理
酵母在糖液中发酵，到某一时刻即行停止，其最大原因之一是由于酒精浓度增高所致。每一种酵母都有其忍耐的最高酒精浓度，酵母的这个特性在应用上很重要。 （三）实验材料
（1）菌种 酿酒酵母 （2）培养基 10Bx麦芽汁 （3）药品 95％乙醇，
（4）器材 无菌试管，吸管，接种针，培养箱等。 （四）方法与步骤
（五）实验结果
若气泡产生时间越早，产气量越大，说明酵母的耐酒精能力越强。
三、酵母菌耐酸能力的测定 （一）实验目的
了解酵母耐酸试验的原理及应用。 学习酵母菌耐酸试验的操作技术。 （二）实验原理
酸对于微生物，除其氢离子的作用外，未解离的酸及酸根，都会发生影响，所以pH值相同的各种酸，与微生物有不同的作用，且酵母菌是一种生酸菌，培养酵母时不断的增加碱量，酵母也可渐渐生酸，可是于不加碱的培养液中，酵母生酸，达其最高度后，即不再增加，此最高度，因菌而异。。 （三）实验材料 （1）菌种 酿酒酵母
（2）培养基 10Bx麦芽汁或曲汁
（3）药品 冰醋酸，75％的乳酸，0.1NNaOH，酚酞 （4）器材 大试管，吸管，接种环，培养箱等。 （四）方法与步骤
（1）贴标签于6瓶上，分别醋0.2，醋0.4，醋0.6，乳1，乳2，乳3号。用1ml无菌吸管，移冰醋酸0.2ml于醋0.2号瓶，0.4ml于醋0.4号瓶及0.6ml于醋0.4号瓶，移75％乳酸1.25ml于乳1号瓶，2.5ml于乳2号瓶，3.75ml于乳3号瓶中，混匀。
（2）各瓶口杀菌，待冷。12支无菌大试管分6组，各组标签记醋0.2号，醋0.4号，醋0.6号，乳1号，乳2号，乳3号。将各瓶培养液倾注于同号的两管。
（3）接种，25℃保温箱中培养。
（4）用滴管及0.1NNaOH液，分别滴定各瓶中所剩培养液的酸度，每次取10ml滴定，反复2次或3次，求其所用NaOH液用的平均毫升数。以α代之。以下式求培养液中含酸量：
醋酸：α／10×0.1×60.05×100／1000＝培养液百毫升含醋酸克数。 乳酸：α／10×0.1×90.08×100／1000＝培养液百毫升含乳酸克数。
各瓶所含酸量，算出计入附表。
（5）3天与1周后观察各管，看酵母是否增殖（沉渣增多）及发酵（有其生出），计入附表。
实验四 酵母菌发酵工艺条件的优化
一．实验目的
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二．实验原理
培养的目的有二：一是寻求发酵培养基的合适配方，二是寻找最佳发酵条件。微生物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程，应用一般的简单比较法很难得到满意的结果，实验室中往往采用正交设计方法，对所研究的菌种进行试验。
正交试验法是一种安排和分析试验的方法，这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的分析方法，获得较好的结果，它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目，利用正交表来进行整体设计。可以同时做一批试验，减少试验次数，缩短试验周期。通过分析，它能告诉我们，哪些因素是显著因素，哪些是非显著因素，以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大小，还能分析出试验误差的大小。
正交试验包括两部分内容，设计试验方案和分析试验结果。 三.实验菌种与材料： 1.菌种：酵母菌
2.发酵培养基：葡萄糖、蔗糖、麦芽粉 3.材料：按正交表配制培养基，确定发酵条件。 四实验设计：
（1）发酵液的配制(见表6,7)
表6 正交表试验设计
因素水平
1 2 3
糖含量（％）
10 15 20
接种量(ml)
3 7 10
温度(℃) 16 22 28
表7 正交表实验方案
编号
1 2 3 4 5 6
糖含量 (A) (1) (1) (1) (2) (2) (2)
接种量 (B) (1) (2) (3) (1) (2) (3)
温度 (C) (1) (2) (3) (2) (3) (1)
糖耗 感官评价
8 9 (3) (3) (2) (3) (1) (2)
1．明确试验目的，确定试验因素，影响发酵的因素很多，考虑到实验室条件及人力和时间，我们不能在一次试验中包括所有因素，本实验主要从葡萄糖、接种量、温度三个因素，每因素选择三个水平，采用正交表Ｌ9（34）。
2．列出水平表，根据生产上发酵的现有了解，把葡萄糖、接种量、温度三个因素各分成三个水平。
3.根据因素水平表（表头设计），把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字。 五、实验结果的观察与记录试验结果分析
1.从正交试验结果中，我们可以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是最佳理论值。我们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范围内，进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差，极差大小反应了因素变化时试验指标变化的幅度，因素的极差越大，该因素对指标的影响也会越大，也就越重要，就更需要控制在最佳水平上。 六、实验延伸
1.要求每位同学设计四因素三水平的正交试验 2.验证正交试验结果。
生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。由于酵母在液体深层通气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的，所以可以采用直接比色法进行测定。
测0D值：将菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定0D值。比色测定时，用以未接种的培养基作空白对照，并将0D值填入表中，最终确定最佳培养基的组成及发酵时间。 七．思考题
(1)比浊计数在生产实践中有何应用价值?
(2)本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度？如果你在实验中需要测定 (3)设计正交试验的科学依据？
实验五 耐高温酵母菌株的诱变选育
一．目的要求
通过实验，观察紫外线对酵母菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二．基本原理
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
测定紫外光的剂量有直接法（以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。微生物所受射线的剂量决定于灯的功率、照射距离和时间。 如果功率和距离是固定的话，则剂量就和照射的时间成正比，故照射时间的长短可作为相对剂量。一般用15W的紫外灯，距离固定在左右，选用致死率达90~99.9%所需的辐射时间进行诱变处理。但各类微生物所需的最适时间不同，一般营养体需辐照3~5分钟，芽孢要10分钟，芽孢杆菌的营养体要1~3分钟，革兰氏阳性菌和无芽孢菌较易杀死，用30秒，放线菌的分生孢子用30秒~2分钟。
辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰；同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热20~30分钟，使光波稳定。 三．菌种与仪器
菌种：酵母菌
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机 四．实验设计 （1）菌悬液的制备
（a）取培养24小时的酵母菌的斜面1支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的大试管中，振荡30分钟，以打碎菌块。
（b）将上述菌液离心（1500r/min，离心5分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 （2）马铃薯琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理
（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
（b）取直径9cm无菌平皿1套，分别加入上述菌悬液6－7ml，并放入无菌大头针于平皿中。
（c）将盛有菌悬液的1平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射30s，60s，90s，120s，150s，180s。
(4) 稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
(5)涂平板取10-5、10-6、10-7三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
(6)培养
将上述涂匀的平板，静置2min后，用黑布（或黑纸）包好，置36℃、42℃、50℃三个不同温度下培养24小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
(7)计数将培养24小时后的平板取出进行计数，根据对照平板上菌落数，计算 1.不同温度下菌的存活率 2.不同紫外线处理时间菌的存活率 3.同一温度下稀释倍数的准确性 五．实验结果的观察与记录
将实验结果填入表8
六．思考题
(1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？
(2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？
表8 耐高温酵母菌诱变结果
实验六 酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵
一、目的要求
了解固定化酶及微生物细胞固定化的原理及其优缺点。 掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。 学会用固定化酿酒酵母进行酒精发酵及酒精的测定方法。 二、基本原理
用发酵法生产的许多产品如乙醇、乳酸、柠檬酸、氨基酸和维生素等，常是由于微生物细胞内的ATP再生和辅酶的多级反应形成的。考虑到微生物细胞可将辅助
因子再生，并且酶在细胞内比提取出来稳定性更高，日本科学家千佃一郎从酶的固定化研究进入了微生物细胞固定化的研究。
固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。该项技术是近代工业微生物学上的重要革新，展示着广阔的前景。
固定化酶的研究开始于50年代初至60年代后半期，发展迅速。由于微生物酶有胞外酶和胞内酶之分，胞外酶由微生物细胞合成后分泌至培养基中；胞内酶在整个培养过程始终保留在细胞内或细胞表面，只有当细胞裂解后才能释放至培养基中，因此，在使用胞内酶时，应先将其从细胞中提取出来。有些胞内酶在提纯、固定化过程中还会失去活性，提纯过程复杂，故提高了成本，给固定化酶带来许多麻烦。此外，有些酶促反应需要多步完成，固定一种酶并不能满足工艺需要。因此，由固定化酶发展到将整个细胞固定化起来，即微生物细胞固定化，其优点是可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定、而微生物不含干扰酶或易去除干扰性酶，若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。
微生物细胞固定化常用载体有（1）多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K- 角叉胶、DEAE- 纤维素等）；（ 2）蛋白质（骨胶原、明胶等）；（3）无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；（4）合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。微生物细胞
固定化常用的方法有三大类：
1．吸附法
吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。①物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。②离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱，pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。 2．包埋法
是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而底物和产物可以进入和渗出。细胞和载体不起任何结合反应，细胞处于最佳生理状态。因此，酶的稳定性高，活力持久，所以目前对于微生物细胞的固定化大多采用包埋法。本次实验作为重点训练。
3．共价交联法
是利用双功能或多功能交联剂，使载体和酶或微生物细胞相互交联起来，成为固定化酶或固定化细胞。常用的最有效的交联剂是戊二醛，这是一种双功能的交联剂，在它的分子中，一个功能团与载体交联，另一个功能团与酶或细胞交联。此法最为突出的优点是：固定化酶或细胞稳定性好，共价交联剂和载体都很丰富。
然而到目前为止，尚无一种可用于所有种类的微生物细胞固定化的通用方法，因此，对某一特定的微生物细胞来说，必须选择其合适的固定化方法和条件。 三、实验材料
（一）菌种 酿酒酵母。 （二）培养基 1．种子培养基YPD
分装 30 ml培养基于 250 ml锥形瓶中，共 4瓶，经 100 Pa灭菌 20 min，备用。 2.酒精发酵培养基YG
分装 200 ml培养基于 300 ml锥形瓶中，共 4瓶，经100 Pa灭菌备用。 （三）主要药品
海藻酸钠、琼脂、K- 角叉胶、葡萄糖、蛋白质、酵母膏、明胶、戌二醛等。 （四）器皿
培养皿、无菌10 ml注射器外套及5# 静脉针头或带喷嘴的小塑料瓶、移液管、小烧杯、玻璃棒、牛角勺、小刀、烧瓶、冷凝管等。
四、实验内容
（一）酵母种子培养液的制备
挑取新鲜斜面菌种一环，接入装有 30 ml YPD培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养，共接 4瓶，培养至对数期。 （二）细胞的固定化 1．包埋法
（1）琼脂凝胶固定化细胞的制备 称取 1.6 g琼脂于 100 ml 小烧杯中，加水 40 ml，火上加热熔化后，100 Pa灭菌 20 min冷却至 50℃左右，加入 10 ml培养至对数期酵母种子液，混合均匀，立即倒入直径15cm的无菌平皿中，待充分凝固后用小刀切成大小为3×3×3mm3 的块状，装入 300 ml锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤 3次，加入 200 ml YG培养液，置 30℃培养72 h。另外，再取 10 ml未经固定化的酵母种子液接入到装有200 ml YG培养液的无菌锥形瓶中作为对照，同样条件下培养 72 h后测酒精含量。
如采用连续发酵法，可使用柱式反应器（图 12-2-1），即将固定化细胞放入12.5×2.8cm 柱中，然后将YG培养基于 30℃，以 50 ml·h-1的速率通过反应柱。包埋细胞在凝胶柱中生长繁殖达到稳定状态。连续添加 YG培养基可维持这种稳定状态。在这种情况下，以填充柱中凝胶珠体积和流加培养基速率比，来表示滞留时间，温度维持在30℃，为了防止填充柱被杂菌污染，通常是在无菌条件下进行的。
（2）海藻酸钠凝胶固定化细胞的制备海藻酸钠凝胶是从海藻中提取获得的藻酸盐，为D- 甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物，多价阳离子如Ca2 、Al3 可诱导凝胶形成。将微生物细胞与海藻酸钠溶液混匀后，通过注射器针头或相似的滴注器将上述混合液滴入CaCl2 溶液中，Ca2 从外部扩散进入海藻酸钠与细胞混合液珠内，使藻酸钠转变为水不溶的藻酸钙凝胶，由此将微生物细胞包埋在其中。在此法的使用中，应尽量避免培养基中含有钙螯合剂（如磷酸根），因为它可导致钙的溶解和释放，并由此引起凝胶的破坏。
称取1.6g海藻酸钠于无菌的小烧杯中，加无菌去离子水少许，调成糊状，再加入其余的水（总量为 40 ml）。火上加温至熔化，冷却至 45℃左右，加入 10 ml酵母培养液，混合均匀，倒入一个无菌的小塑料瓶中或注射器外套并与针头相连，通过 1.5～2.0 mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有 10％CaCl2 （胶诱导剂）溶液的平皿中制成凝胶珠。浸泡 30 min后，将凝胶珠转入 300 ml锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤三次后加入 200 ml YG培养基，置 30℃培养 72h测定酒精含量。
（3）K- 角叉胶固定化细胞的制备K- 角叉胶是一种从海藻中分离出来的多糖，其化学组成为β-D-半乳糖硫酸盐和3，6- 脱水-α-D- 半乳糖交联而成。热K- 角叉胶可经冷却或经
胶诱生剂如K 、NH4 、Ca2 、Mg2 、Fe3 及水溶性有机溶剂诱导形成凝胶。 K- 角叉胶固定微生物细胞有许多优点，如凝胶条件粗放，凝胶诱生剂对酶活性影响很少，细胞回收方便，因此，目前多选用它作载体。
称取1.6gK- 角叉胶，于小烧杯中加无菌去离子水，调成糊状，再加入其余的水（总量为40 ml），火上加温至熔化，冷却于 45℃左右，加入10 ml预热至 31℃左右的酵母培养液。混合后倒入带有小喷嘴的塑料瓶中或注射器外套并与小针头相接，通过直径为 1.5～2.0 mm的小孔，以恒定的速度滴到装有已预热至 20℃、2％ KCl溶液的平皿中制成凝胶珠，浸泡30 min 后，将凝胶转入300 ml锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤三次后，加入 200ml YG培养液，置30℃恒温箱培养 72 h，观察结果；同时取出 2粒凝胶置于无菌生理盐水中浸泡，然后放 4℃冰箱保存，留作计算细胞活菌数。 2．共价交联法
吸取 10 ml培养到对数期的酵母菌悬液加入加 25 ml2％的明胶液中，混合均匀，倒入15 cm的无菌平皿中，在0～5℃冻结后，切成3×3×3mm3 小块，再浸入1.5％戊二醛中，室温下交联 3 h，将颗粒转入 300 ml锥形瓶中，用无菌去离子水洗涤三次，加入YG培养基，置30℃培养 72 h后测定酒精含量。 （三）结果观察
1．固定化细胞的回收与活菌计数
（1）取培养72 h的固定化细胞，如含酵母的K- 角叉凝胶包埋珠2粒，放入5 ml无菌生理盐水中。培养前的凝胶珠同样处理。 （2） 37℃轻振 15 min，使胶珠溶解。
（3）适当稀释后涂布于YPD琼脂平板进行活菌计数，观察酵母菌在包埋块中的增殖情况。 2．酒精发酵液的蒸馏及酒精度的测定
（1）由于本次实验发酵液中所含酒精度较低，因此可用明火直接加热蒸馏（图12-2-2）。 （2）取100 ml发酵液，倒入500 ml圆底烧瓶中，加100 ml蒸馏水蒸馏，沸腾后改用小火。当开始流出液体时，用 100 ml容量瓶准确接收馏出液 100 ml。倒入 100 ml量筒中，用酒精比重计测量其酒精度。剩余的发酵液全部倒出后弃去，将固定化细胞用无菌去离子水洗3次，加入 YG培养基继续培养 72 h，测酒精含量，可反复使用数十次。