安徽农学通报，ＡｎｈｕｉＡｇ吨Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．２０１１。１７（０３）
几种微生物表达系统的比较
陈
明
陈文静
（福建师范大学生命科学学院．福建福州３５０１０８）
摘要：微生物表达系统是用于蛋白质生产及性质研究的重要基础。常用的微生物表达系统有大肠杆菌表达系统，酵母表达系统和丝状真菌表达系统。该文主要介绍了上述表达系统的优缺点，并作比较分析。关键词：表达系统；大肠杆茵；酵母；丝状真菌中图分类号Ｑ９３９．１２１
文献标识码Ａ
文章编号１００７—７７３１１２０１１）０３—６８—０４
ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｓｏｆＳｏｍｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ
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随着现代生物技术的发展，利用各种表达系统进行外源基因表达成为商业蛋白生产的重要手段。微生物表达系统具有培养简单，周期性短，成本低等优点，是商业性蛋白重要的表达来源。常用的微生物表达系统主要有大肠杆菌表达系统，酵母表达系统以及丝状真菌表达系统。
大肠杆菌表达真核蛋白的基因，一般只能以ｃＤＮＡ的形式克隆至载体，而且设计时应从活性蛋白编码序列开始，甚至可以在真核基因ｃＤＮＡ上游添加原核信号肽序列进行分泌表达Ｈ１。（３）真核基因的ｍＲＮＡ与原核基因在结构上存在差异。真核基因ｍＲＮＡ的３’端存在ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴，５’端具有帽子结构，而且真核ｍＲＮＡ没有ＳＤ序列，这些降低了真核基因ｍＲＮＡ在大肠杆菌中的稳定性，不利于同核糖体的结合。真核基因的启动子无法被原核细胞的ＲＮＡ聚合酶识别。现在常常把真核基因插入至原核启动子下游来解决这个问题。（４）真核生物与原核生物密码子偏好性不同，若外源基因存在较多大肠杆菌的稀有密码子，基因转录步骤将不能有效进行，最后影响该基因在大肠杆菌系统中的高效表达。（５）蛋白在大肠杆菌内多数为非分泌型表达，细胞内杂蛋白多。制备目的蛋白，不仅需要破碎细胞，而且分离纯化不方便。（６）真核蛋白在细胞内高度表达，然而又不能有效分泌到胞外，常常在胞内形成不溶性的包涵体。包涵体是同一种蛋白在体内大量的累计、聚集形成的颗粒状物质，没有生物活性，包涵体解体后蛋白也很难复性成有功能的蛋白分子。为解决包涵体问题，常用的方法有：外源蛋白的分泌表达。导人外源蛋白的分子伴侣、折叠酶共表达，帮助其在细胞内正确折叠，并稳定构象”’。Ｔａｅｋ
Ｈｏ
ｌ大肠杆菌表达系统
在多种表达系统中，大肠杆菌表达系统是目前研究最为深入，发展最迅速的原核表达系统。作为生命科学研究的模式生物之一，大肠杆菌不仅在遗传学背景，基因表达调控机理方面的研究已经非常清晰，而且拥有多种适应不同表达的载体和宿主菌。大肠杆菌可以表达多种多肽和蛋白质，具有生长繁殖快，培养简单，低成本，表达量高的特点，目前已成为实验室首选的外源表达系统。原核蛋白在大肠杆菌体内表达，可以得到天然构象；外源真核蛋白如果具有以下性质：分子量小于７０ＫＤａ、不含半胱氨酸、二硫键低于３个，不需要翻译后修饰，多数也可以在大肠杆菌表达系统中获得较好的结果¨。１。
然而作为原核生物，大肠杆菌的外源表达依旧具有以下缺点：（１）大肠杆菌系统不具有真核细胞翻译后修饰加工的功能，无法帮助真核蛋白糖基化，磷酸化，正确折叠和分泌等Ｈ１。（２）大肠杆菌无转录后剪切过程，无法识别真核基因内含子区域。天然的真核基因在大肠杆菌细胞内不能转录为成熟的ｍＲＮＡ，转录水平的限制也导致翻译难以进行。另外如果真核基因携带自身前肽，则翻译后的蛋白将以前体形式存在，很难形成有活性的成熟蛋白。所以
Ｙａｎｇ等最近导入脂肪酶特定
的折叠酶成功实现共表达并使脂肪酶表现活性旧Ｊ。另外，采用外源蛋白与蛋白标签融合的方式，也有利于外源蛋白溶解性增强。大肠杆菌的翻译一般从甲硫氨酸开始，因此
收稿日期：２０１ｌ一０ｌ一１４
作者简介：陈明（１９８６一），女，福建福州人，在读研究生，研究方向：基因工程。
万方数据
１７卷０３期
胨明等几种微生物表达系统的比较
外源蛋白的Ｎ端与天然不同，常常多出一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。
表达载体是影响外源基因在大肠杆菌系统表达的一个重要闪素。目前常用的表达载体有非融合表达载体、融合表达载体，分泌型表达载体以及表面展示表达载体¨。。
１．１
非融合表达载体使用非融合表达载体表达的蛋
白，基本不含大肠杆菌自身序列，与天然蛋白在序列、功能上基本保持一致，只是在蛋白Ｎ端常常会多出一个甲硫氨酸残基，引起免疫反应。而且，非融合蛋白在大肠杆菌细胞内容易被降解。１．２融合表达载体
原核ＲＮＡ聚合酶的识别作用和核
糖体结合位点是基因高效表达的基础。融合表达是在完整的原核表达序列Ｃ端添加外源基因序列，利用原核启动子、ＳＤ序列等的元件，加强转录识别和翻译能力，实现真核基因的高效表达。构建融合表达载体可以简化基因操作，防止外源蛋白在体内降解。但是融合表达结果使目的蛋白Ｎ端残留原核多肽片段，这在医学上增加了目的蛋白的免疫原性。
１．３分泌型表达载体分泌型表达的策略是使用原核信号肽构建表达载体。大肠杆菌能够识别原核信号肽，外源蛋白在原核信号肽后表达，随后被其带人细胞膜周质，大肠杆菌信号肽酶识别并切割信号肽，将外源蛋白释放至胞外，形成具有天然构象的成熟活性蛋白。这种构建方式能使外源基因在细胞内有效转录和翻译，也是防止外源基因产物在细胞内被蛋白酶降解的良好方法。ＲａｈｍａｎＲＮ等使用编码细菌素释放蛋白的Ｐｊｌ３载体与Ｔｌ脂肪酶共表
达，并将Ｔ１脂肪酶分泌至胞外。用ＩＰｒＧ诱导１２ｈ，Ｏｒｉｇａ－
ｍｉ
Ｂ分泌出的脂肪酶活性达到１８１００Ｕ／ｍＬ哺１。
１．４表面表示表达载体表面展示是研究蛋白质和进行文库筛选的有效手段。大肠杆菌表面展示常将外源基因片段连到脂蛋白等的两端，或整合至大肠杆菌鞭毛或纤毛的结构基因中，或者将目的蛋白编码序列插入外膜蛋白的表面暴露部位的ｌｏｏｐ区。Ｔａｅｋ
Ｈｏ
Ｙ锄ｇ等将“ｆ蛋白与洋
葱假单胞菌脂肪酶共表达，并利用自动转运蛋白ＥｓｔＡ的Ｃ末端转座基ＥｓｔＡＴｕ成功实现脂肪酶在大肠杆菌表面活性展示旧Ｊ。
２酵母表达系统
酵母菌是一种单细胞的低等真核生物。相较于原核生物，它能够识别真核基因帮助其进行转录翻译后修饰，并将蛋白分泌至胞外。酵母菌由于安全可靠，培养周期短，生长迅速，操作简单，又能弥补原核表达系统在表达真核基因方面的不足，因此成为最普遍的真核表达系统之一。酵母表达系统有很多，如酿洒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和产朊假丝酵母等，其中酿酒酵母和毕赤酵母是最常用的２种酵母表达
万方数据
系统一。…。
２．１酿酒酵母表达系统
酿酒酵母长期应用在食品工
业，安全可靠，不产毒素，因此成为最先使用的酵母表达系统。作为生物模式物种之一，酿酒酵母的遗传背景已经十分清晰，方便用于遗传改造。许多实验室选择酿酒酵母作为脂肪酶的外源表达系统¨。“Ｊ。刘文山等利用ｄ凝集素系统，采用ＰｃＲ方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶ｕｐ２成熟肽编码基因ＬＩＰ２，将其连接到ＡＧＡ２基因的下游构建表面展示载体ｐｃｒＩ＇ＬＩＰ２，成功将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶“ｐ２展示在酿酒酵母表面，构建了酿酒酵母全细胞
催化剂。２０℃，半乳糖诱导７２ｈ，酶活可达１８２ｕ／ｇ干细胞【１５｜。潘志友等也成功将南极假丝酵母脂肪酶Ｂ在酿酒酵母表面展示并具有催化己酸乙酯的特性¨“。
酿洒酵母表达系统地优点是：（１）生长繁殖快，培养周期短。操作简单。生产成本低。（２）最为模式物种之一，遗传背景已十分清晰，基因组全序列测序工作已在】９９６年完成。（３）长期广泛应用于食品１＝业，安全可靠。（４）可对真核基因进行转录翻译后修饰，表达蛋白接近天然构象。（５）酿酒酵母能分泌外源蛋白，有利于表达产物的纯化。缺点是：（１）酿酒酵母是低等真核生物，虽然能够对真核蛋白进行翻译加工，但是能力有限，对于高等真核蛋白，在空间上与天然构象存在差异。与原核表达系统相比较，酿酒酵母表达系统对外源细胞因子的表达存在过度糖基化的问题。过度糖基化会增强目的蛋白的抗原性。
（２）外源基凼在酵母中的表达效率主要与启动子，分泌信号和终止序列有关Ⅲｏ。酿酒酵母缺乏强有力的启动子，一般分泌分子量在３０ＫＤａ以下的目的蛋白。酿洒酵母不
适宜高密度培养，无法满足好氧发酵的蛋白生产。因此酿酒酵母发酵生产时，不易高水平表达外源蛋白。
为克服上述不足，人们目光逐渐转向另一种新型酵母
表达系统一毕赤酵母表达系统。。
２．２毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统是几年来研究最热的表达系统，也是脂肪酶的外源表达使用最为普遍的表达系统。
毕赤酵母中有２个编码醇氧化酶ＡＯＸ的基因Ａ０ｘ１和Ａ０ｘ２。提供甲醇作为唯一碳源的情况下，甲醇能迅速诱导毕赤酵母合成醇氧化酶Ａ０ｘ。其中ＡＯＸｌ基因是毕赤酵母最常用的启动子，也是目前已知最强的受严格调控的启动子，含有Ａ０ｘｌ基因的菌株（ＳＭＤｌｌ６８和ＧＳｌｌ５菌株）能快速利用甲醇生长。Ａ０）【２与Ａ０ｘｌ有９２％的同源性，但其启动子弱于Ａ０ｘｌ，只含有Ａ０）（２的菌株（ＫＭ７）利用甲醇速率则相对缓慢，不含ＡＯｘｌ和Ａ０ｘ２的菌株（ＭＣｌｏｏ），无法利用甲醇生长¨引。上述这些菌株均由野生菌株ＮＲ．ＲＬＹ１１４３０改良而成。
用于毕赤酵母表达系统地载体大多是穿梭载体，如
ｐＨＩＬ—Ｄ２，ｐＡ０８１５，ｐＰＩＣ３Ｋ，ｐＰＩＣＺ，ｐＧＡＰＺａ，ｐＰＩＣ３．５Ｋ，
安徽农学通报，ＡｎｈｕｉＡ酣．Ｓｅｉ．ＢｕｌＬ
ｐＰＩＣ９，ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＨＩＬ—Ｓ１，ｐＰＩＣＺａＡ，ｐＹＡＭ７５Ｐ等，适合在
２０１
Ｉ，１７（０３）
丝状真菌作为外源表达系统的优点可以简述为：（１）生产应用历史悠久，培养简单，成本低，安全性已经得到证实。（２）蛋白质分泌能力卓越，同源蛋白的分泌量可以达到几十克每升，异源蛋白也能达到几百毫克每升，在构巢曲霉中表达的牛凝乳酶原的分泌量甚至超过一克每升ｏ（３）除发现有少数自主复制质粒的转化外，丝状真菌一般是整合转化，筛选的重组子稳定，有利于遗传育种Ⅲ１。（４）翻译后蛋白的修饰和折叠更接近高等真核生物，一些在细菌和酵母中不能表达的蛋白可以在丝状真菌中表达。
然而．丝状真菌作为表达系统也有局限性。丝状真菌对同源蛋白（真菌来源）的表达比较理想，分泌表达量高达几克到几十克每升，对异源蛋白（主要是哺乳动物和植物来源）的表达不是十分突出，一般只有几十毫克每升。一般认为影响产量的因素主要有：（１）丝状真菌自身蛋白酶的对蛋白的降解作用。异源蛋白比同源蛋白敏感，更容易被蛋白酶水解。（２）转录过程ｍＲＮＡ水平和ｍＲＮＡ稳定性。外源蛋白含有大量宿主稀有密码子不利于ｍＲＮＡ生成。ｍＲＮＡ的长度、５’甲基帽子结构和３’ｐｏｌｙＡ尾巴等也是不利于ｍＲＮＡ稳定，影响蛋白表达的因素。（３）翻译水平上，折叠酶或分子伴侣短缺，内质网，高尔基体不能正确加工和分泌蛋白也是限制外源蛋白分泌表达的因素。
为解决上述影响，现在常用的几种策略有：（１）使用高效强启动子。现在常用的强启动子有米曲霉的淀粉酶基因启动子ａｍｙＢ，来自黑曲霉的葡萄糖淀粉酶启动子
大肠杆菌中扩增后整合到巴斯德毕赤酵母基因组。表达载体整合至毕赤酵母基因组有２种交换方式，一种是载体的５’ＡＯＸ到３’ＡＯＸ片段以单交换方式直接插入基因组ＡＯＸｌ基因上游或下游，发生同源重组，这种整合方式不破坏ＡＯＸｌ基因，容易引入高拷贝基因；另一种是双交换，载体的５’ＰＡＯＸ到３’ＡＯＸ片段（含目的基因序列，终止子以及ＨＩＳ４标志）取代ＡＯＸＩ基因整合在基因组中。这种双交换方式一般得到单拷贝基因，遗传稳定性较好，但发生几率较单交换低。
毕赤酵母作为外源表达系统具有以下优点：（１）毕赤酵母具有最强启动子一ＡＯＸ启动子，在甲醇存在下即可高效诱导外源基因高水平表达。（２）与酿酒酵母相比，毕赤酵母适合高密度培养，适宜大批量发酵生产外源蛋白，有利于工业化应用。（３）外源蛋白可进行胞内表达也可分泌表达，是否分泌表达与信号肽的存在与否有关。外源蛋白分泌表达可以使用酵母信号肽也可以使用自身天然信号肽。ｐＰＩＣ９载体系列和ｐＰＩＣＺ载体系列是已经包含有酵母信号肽的毕赤酵母表达载体，适用于外源基因的分泌表达。（４）外源蛋白在毕赤酵母系统中为整合表达，不存在游离的质粒，因此遗传稳定。（５）可以进行转录翻译后的加工修饰，翻译后修饰与高等真核生物相近，糖基化程度比酿酒酵母低与哺乳类细胞相同，没有免疫原性，可应用于医疗。（６）基因水平操作简单，适合工程菌构建。缺点是是以甲醇为诱导物，容易产生毒性¨…。
ｇｌ“，构巢曲霉的３一磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子ｇｐｄＡ
和受乙醇、乙胺、酮类诱导的ａｌｃＡ、ａｌｃＲ启动子，Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ的外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ｉ基因启动子ｃｂｈｌ等瞄。’。（２）使用融合蛋白。应用最多的是葡糖淀粉酶基因。方法是异源蛋白基因取代葡糖淀粉酶催化结构的Ｃ端结合区，保留Ｎ端催化区和Ｎ端和Ｃ端问的间隔区。通过这种方式产生的融合蛋白分泌到胞外后可以被蛋白水解酶特异降解Ｎ端氨基酸序列，得到目的蛋白。（３）构建蛋白酶缺陷株。常用的方法有传统诱变方式筛选产蛋白酶缺陷株，直接敲除蛋白酶基因或者敲除重要的调节基因，以及反义ＲＮＡ策略抑制蛋白酶表达旧。ｏ。（４）增强基因拷贝数。（５）培养条件优化。丝状真菌形状不同，常常表达蛋白的水平也不同。适当选取合适的培养基类型，可以改变丝状真菌的形态，促进蛋白表达分泌。如黑曲霉ＡＢ４．１菌株，在固定化培养系统中产葡糖淀粉酶一ＧＦＰ的产量是摇瓶培养的１０倍。
３丝状真菌表达系统
人们很早就学会利用黑曲霉，米曲霉进行发酵，生产酱油，米酒，奶酪等食物用料。长期的生产应用，尤其是在食品行业的突出表现，使得丝状真菌在应用上的安全性不断得到证实，黑曲霉和米曲霉被美国食品和药品管理局认为安全性达到ＧＲＡＳ级。丝状真菌生长能力强，能在简单、便宜的培养基中生长，在表达和分泌蛋白方面，也具有明显的优势，能够表达多种具有商业开发价值的蛋白，因此长期得到人们的关注。随着１９７９年Ｃａｓｅ等人首次在粗糙脉孢霉中建立了ＤＮＡ转化系统，人们逐渐发现丝状真菌作为外源基因表达系统的优越性，并开始致力于丝状真菌在基因表达上的研究Ⅲ］。现在，随着生物技术手段的进步，利用丝状真菌已经成功表达牛凝乳酶原、Ｆａｂ抗体片段、人体白细胞介素一６和ｌ，２一Ｏｔ一甘露糖苷酶等口“。丝状真菌作为细胞工厂广泛应用于多种产品的生产，也成为真菌来源酶与非真菌来源酶生产中不可缺少的表达宿主。现阶段，天然或重组的酶主要是由黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等产生陋埘Ｊ。除此之外，丝状真菌自身能够产生次级代谢产物丰富，多数已经成为生物技术下的产物，并成为具有临床意义的药物。
４结语
微生物基因表达系统种类较多。大肠杆菌体系研究最为深入，仍然是基因工程基础研究首选的微生物基因表达系统。酵母表达系统，尤其是毕赤酵母表达系统，外源蛋白表达量高，遗传背景清晰，是近年研究最热，使用最多
万方数据
１７卷０３期陈明等几种微生物表达系统的比较
７ｌ
的外源真核微生物表达系统。虽然毕赤酵母在基因调控表达研究方面较为热门，却不是商业性蛋白最佳的表达系统，人们更倾向于选择丝状真菌作为商业蛋白的表达宿主。丝状真菌外源蛋白分泌表达量与毕赤酵母表达系统相当，培养简单、成本低，转录翻译修饰水平接近高等真核生物，特别是发酵产物安全性高，具有商业化生产的优越性。毕赤酵母表达系统出于安全性，甲醇诱导的毒性以及培养成本等因素考虑，在产业化选择上受到限制。参考文献
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（责编：施婷婷）
几种微生物表达系统的比较
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
陈明， 陈文静
福建师范大学生命科学学院,福建福州,350108安徽农学通报
ANHUI AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN2011,17(3)
参考文献(60条)
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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_ahnxtb201103029.aspx