玉米自交系游离氨基酸HPLC测定与分析

2011，23（4）：651－654浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis ，http ：//www．zjnyxb．cn

J ］．浙江农业学报，2011，23（4）：651－654．姬玉梅，赵丽维．玉米自交系游离氨基酸HPLC 测定与分析［

玉米自交系游离氨基酸HPLC 测定与分析

1，21

姬玉梅，赵丽维

（

1

河南科技学院河南省高等学校作物分子育种重点学科开放实验室，河南新乡453003；2鹤壁职业技术学院，河南鹤壁458030）

摘要：为了解玉米自交系的氨基酸品质性状，筛选出高游离氨基酸含量的自交系，为玉米育种和品质改良

‘Opaque-2’提供优质种质资源。试验利用HPLC 方法，对高赖氨酸玉米和13个常用玉米自交系的16种游离，‘Opaque-2’氨基酸含量进行了检测。结果表明材料中检测出15种游离氨基酸，总游离氨基酸含量达干物质总量的3. 42%，赖氨酸含量达0. 28%。13个常用自交系除1个含量稍高外，其余12个自交系游离氨基酸‘Opaque-2’和必需氨基酸含量都很低，赖氨酸含量仅是的0 34%。该结果说明目前常用玉米主要品种亲本自交系的必需氨基酸营养品质基因是低水平类型。关键词：玉米；自交系；游离赖氨酸；种质资源；高效液相色谱中图分类号：S 513

文献标志码：A

文章编号：1004－1524（2011）04－0651－04

Detection and analysis of free amino acids in main maize inbred lines by HPLC method

2

JI Yu-mei 1，，ZHAO Li-wei 1

（1Key Discipline Open Laboratory on Crop Molecular Breeding of Henan Institute of Higher Learning ，Henan Institute of Science and Technology ，Xinxiang 453003，China ；2Hebi Vocation Technical College ，Hebi 458030，China ）Abstract ：In order to study the quality and traits of amino acid in maize inbred lines ，and to screen out the inbred line with high levels of free amino acids to provide high-quality germplasm resources for maize breeding and quality improvement ，sixteen kinds of free amino acids extracted form high-lysine corn Opaque-2and thirteen commonly used inbred lines were detected using HPLC method．The result showed that fifteen kinds of amino acids were detected in Opaque-2，and the content of all free amino acids accounted up to 3. 42percent of total dry matter ，while that of ly-sine was up to 0. 28percent．The content of free amino acids and essential amino acids were very low in the thirteen commonly used inbred lines with the exception of only one line ，while the content of lysine was only 0－34percent of the content of lysine in Opaque-2．In summary ，it showed that the genes of essential amino acids in their parents in-bred lines of commonly used maize varieties with excellent nutritional quality were scarce．Key words ：maize ；inbred line ；free amino acids ；germplasm resources ；HPLC

玉米是世界上种植面积最大的谷类作物之

一，产量居世界谷物总产量的前列。我国的玉米总产和单产仅次于水稻居第2位，约占全国粮食

收稿日期：2010－12－27

基金项目：河南省自然科学基金资助项目（0511031100）作者简介：姬玉梅（1975－），女，河南辉县人，讲师，在职研究生，

mail ：hbjym6@163．com ；Tel ：主要从事作物遗传育种研究。E-[1**********]

总产量的28%

［1］

。玉米集粮食、工业、饲料三大

用途于一身，既有巨大的开发潜力，又是保证粮食安全的重要组成部分。在我国，玉米的饲料用

玉米营养品质改良在品种改良中有途比重最大，

重要地位，特别是提高赖氨酸等必需氨基酸含

量，在近几十年的玉米育种研究中一直是育种工作者努力的目标

［2，3］

。高赖氨酸玉米又称优质蛋

白玉米（QPM ），指玉米籽粒胚乳蛋白质中赖氨酸

［4］

的含量超过普通玉米含量60%的优质玉米。玉米自交系是玉米杂种优势利用的基础，自交系

然后在反应液中加入600μL 正生反应10h 以上，

12000r ·min －1离心10min ，己烷振荡萃取5min ，

0. 45μm 滤膜超滤至样本瓶中。取下层液，

1．2. 4HPLC 测定

高效液相色谱仪是日本岛津公司的LC-2010AHT ，LC-10ADVP 泵系统，高压梯度紫外波10AVP ，10ADVP ，长检测器SPD-自动进样器SIL-A （C ）VP ，10AVP ，柱温箱CTO-系统控制器SCL-色谱工作站全自动控制。1．2. 5色谱条件

pack VP-ODS （4. 6mm ˑ 150色谱柱：shim-mm ）；柱温：38ħ

－1

流动相A ：0. 1mol ·L 醋酸盐缓冲液（2. 494g NaOAc ·3H 2O 溶于适量水中，加200μL 三乙胺，用体积分数为2%的醋酸调pH 至7. 2，然后

的选育和改良是玉米育种工作中的重要环

［5－7］

。通过有目的选育和筛选赖氨酸含量高节

的自交系，为选育优质蛋白玉米杂交种奠定资源［8，9］

。本试验采用HPLC 方法检测高赖氨酸基础

‘Opaque-2’玉米和13个常用自交系游离氨基酸

的含量，以进一步探讨玉米自交系氨基酸的组成及含量，为玉米育种提供参考。

1

1．1

材料与方法

材料

供试材料：试验材料为13个常用玉米自交

2’，系和高赖氨酸玉米‘Opaque-由河南科技学院13个自交系分别是‘246’、玉米研究中心提供，

‘9508’、‘昌7-2’、‘郑32’、‘488选’、‘533’、‘543’、‘浚28B ’、‘PH6WC ’、‘478’、‘U8’、‘CT03’、‘郑58’。

所用试剂：乙醇，磺基水杨酸，四氢呋喃，三乙胺，正己烷等，均为上海伯奥生物科技有限公司生产的分析纯产品，乙腈、甲醇为色谱纯产品，标准氨基酸由中国农业科学院分析检测中心生产。1．2方法1．2. 1

材料处理

选灌浆良好且无病虫害的玉米自交系自交穗子，自然风干，选穗中部籽粒20g ，谷物籽粒粉24h 碎机粉碎成粉末（＜100目），置烘箱40ħ ，以上，保持恒重。1．2. 2

游离氨基酸提取

取粉碎的样品粉末，四分法分样，称重25mg ，在研钵中加适量石英砂研磨5min ，加入80%酒精1mL 继续研磨至酒精挥发。然后加入4%磺基水杨酸1. 2mL 研磨成浆状，将浆状样品洗12000r ·入1. 5mL 离心管，超声提取20min ，min －1离心15min ，取上清液。再加4%磺基水杨12000r ·min －1离酸1mL 复提，超声提取10min ，心15min ，取上清液与前次上清液混合。1．2. 3

氨基酸柱前衍生

［10］

使用PTC-柱前反应衍生法：取上述提取的

·L －1乙腈上清液300μL ，加入150μL 的100mmol

加入3mL 四氢呋喃，定容后用0. 45μm 的滤膜

过滤后备用。

3H 2O 溶于流动相B ：称取13. 608g NaOAc ·

用体积分数2%的醋酸调至pH 7. 2，适量水中，

400取上述溶液200mL ，分别加入400mL 甲醇，

mL 乙腈，混匀后用0. 45μm 滤膜过滤后备有。

流动相梯度洗脱程序为：

TIME FUNC VALUE 13．0023．0129．0035．0040．0045．0047．0167．00

B．CONC B．CONC B．CONC B．CONC B．CONC B．CONC B．CONC Controller

[1**********]0STOP

·min －1，流速1mL 检测波长254nm ，进样体积4μL 。

2结果与分析

16种氨基酸混合标准溶分析行程设67min ，

液在3. 537min 时第一个氨基酸天冬氨酸被检测39. 246min 时最后一个氨基酸赖氨酸被检测出，

出（图1）。图2是6个材料的HPLC 检测结果（其余8个材料色谱图峰线平缓，略），表1是其中10个材料中16种游离氨基酸的含量（其余4

·L －1三乙胺，溶液和150μL 的1mol 室温（20ħ ）衍

个材料含量相近，略）。10个材料游离氨基酸总：‘Opaque-2’＞‘246’量从大到小的顺序依次为

＞‘9508’＞‘478’＞‘543’＞‘488选’＞‘昌7-533’

。2’＞‘郑32’＞‘郑58’＞‘

0. 23%（含量浓度ˑ 分子量ˑ 稀释倍数，氨基酸

的平均分子量为128. 0，苏氨酸分子量119. 13，稀释倍数为100）

。

图1·L －1）十六种标准氨基酸的HPLC 图（0．125mol

Fig．1HPLC graph of 16standard amino acids （0．125mol ·L －1）

2．1

十三个自交系的检测结果

从检测的结果可以看出，除‘246’外，其他

·L －1标样氨基酸、246、9508、注：A 图中由下至上分别为0. 25μmol

2；B 图中由下至上分别为0. 125μmol ·L －1标样氨基酸、昌7-CT03、U8、Opaque-2

12个自交系材料色谱图峰线平缓，游离氨基酸含量都较低，重要的必需氨基酸（赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸）含量低，甚至为0。‘246’是玉米杂交种‘安玉8号’、‘洛玉2号’等组合的亲本，是一个

容重高，品质优，游离氨基酸总量硬质型自交系，

－1

达0. 514μmol ·L ，苏氨酸含量达0. 19μmol ·L －1（表1），相当于干物质总量的0. 66%和

图2rials

六个试验材料的游离氨基酸HPLC 图

Fig．2HPLC graph of free amino acids of 6experimental mate-

表1·L －1）十三个玉米自交系材料中游离氨基酸的含量（μmol

Content of free amino acids in 10inbred lines of maize （μmol ·L －1）

氨基酸Asp Glu Ser Gly Arg Thr Ala Pro NH3Tyr Val Met Cys Ile Leu Phe Lys

保留时间/min3. 5374. 49011. 83712. 81117. 71518. 57219. 38920. 32120. 84021. 48728. 71629. 89330. 78534. 82835. 18537. 99439. 246

2460. 0000. 0050. 0000. 0000. 0000. 1900. 0320. 0490. 0450. 0140. 0220. 0180. 0000. 0440. 0000. 0290. 0660. 514

95080. 0080. 0050. 0010. 0000. 0120. 0850. 0000. 0450. 0800. 0130. 0080. 0030. 0000. 0020. 0000. 0320. 0080. 302

5430. 0150. 0000. 0450. 0180. 0000. 0450. 0000. 0110. 0170. 0350. 0040. 0010. 0140. 0050. 0000. 0360. 0000. 246

488选0. 0000. 0000. 0440. 0180. 0050. 0180. 0090. 0150. 0120. 0050. 0030. 0030. 0000. 0040. 0000. 0460. 0040. 186

2昌7-0. 0050. 0020. 0010. 0050. 0000. 0450. 0000. 0220. 0080. 0000. 0020. 0010. 0000. 0020. 0220. 0330. 0020. 150

郑320. 0060. 0040. 0000. 0100. 0000. 0160. 0000. 0120. 0130. 0020. 0010. 0010. 0000. 0040. 0000. 0460. 0080. 123

郑580. 0110. 0000. 0180. 0030. 0040. 0120. 0010. 0030. 0020. 0020. 0030. 0000. 0130. 0050. 0000. 0360. 0000. 113

5330. 0110. 0000. 0100. 0000. 0020. 0210. 0000. 0180. 0050. 0000. 0000. 0030. 0000. 0060. 0000. 0340. 0000. 110

4780. 0080. 0000. 0130. 0040. 0030. 0080. 0310. 0030. 0010. 0000. 0010. 0000. 0140. 0060. 1310. 0050. 0000. 228

Opaq ue-20. 0000. 6890. 0860. 7250. 0910. 0540. 1540. 0650. 0890. 0830. 0380. 1630. 0920. 0760. 0210. 0590. 1902. 675

Table 1

序号[***********]4151617总含量

2．2‘Opaque-2’有较高的游离氨基酸含量B 可看出，‘Opaque-2’从图2-的色谱图有较

多峰的出现，说明有较多的游离氨基酸。从表1可看出，其谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸5种氨基酸的游离态氨基酸含量高，总游离氨·L －1，基酸含量达2. 675μmol 赖氨酸含量达0. 19

·L －1，μmol 分别相当于干物质总量的3. 42%和0. 28%。

余自交系的游离氨基酸含量甚微。这可能有两

方面的原因，一是这些材料中与必需氨基酸和总游离氨基酸含量相关的基因资源贫乏；二是这些材料中有价值的氨基酸大都以结合态形式存在。参考文献：

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3讨论

本试验检测的13个自交系，是目前生产上

、‘昌7-2’、玉米杂交种的骨干亲本，如‘郑58’‘9058’、‘PH6WC ’、‘浚单’等，是‘郑单958’系、‘先玉335’列等生产骨干品种的亲本，这些品

种产量高、抗性好，但营养品质表现一般，究其原因，是亲本缺少优质营养基因。要改良玉米营养品质，首先要从自交系入手，引进和创造新的优在源头上改进玉米遗传背景。试验结果良种质，

，‘Opaque-2’表明中检测出的游离氨基酸总含量高，种类多达15种，这与Mertz 等研究结果相［11］

2’近，说明‘Opaque-中高游离氨基酸和必需氨基酸含量相关的基因仍然是今后玉米育种中

值得积极利用的资源。

此外，本研究检测的13个自交系，只有‘246’有较高含量的游离氨基酸，苏氨酸含量超‘Opaque-2’，2’但赖氨酸仅为‘Opaque-的过了34%，‘Opaque-2’总游离氨基酸是的19. 2%。其

（责任编辑张韵）