黑曲霉发酵生产柠檬酸
柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O, 相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii ) 和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的
了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
2、实验原理
黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”, 代谢流汇集于柠檬酸处, 使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为:
C 6H 12O 6+1. 5O 2→C 6H 8O 7+2H 2O
柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料
① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。
③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。
④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。
（2） 试剂
0.1429mol/L NaOH、1%酚酞试剂、斐林甲和乙溶液、0,01%标准葡萄糖溶液、淀粉酶（中温酶和高温酶）
（3） 实验流程
保藏菌株→ 活化菌株（斜面培养）→ 200mL 三角瓶麸曲培养→500~1000mL三角瓶液体发酵。
（4）斜面培养基:
① 马铃薯琼脂培养基 去皮马铃薯200g 切成小块，加水约500mL ，煮沸30min ，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖20g ，琼脂20g ，溶化后自来水定容至1000mL ，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内，121℃灭菌20min ，取出摆成斜面备用。
② 麦芽汁琼脂培养基 2/3大麦芽加1/3大米磨碎成粉，按麦芽粉:水＝1:4比例加水，置60℃下糖化4h 至碘液显示无色，然后离心15min ，获得麦芽汁（或取啤酒厂未加酒花的麦芽汁）调整浓度50Brix ，添加25g/L琼脂，分装于经干热灭菌后的带棉塞试管内。于121℃灭菌15~20min，取出摆成斜面备用。
③ 一级种子（麸曲种子）培养基 含麸皮的查氏培养基（g/L）：蔗糖 30；KNO 3 1.0；K 2HPO 4 1.0；MgSO 4·7H 2O 0.5；KCI 0.5；FeSO 4·7H 2O 0.01；调节pH7.0~7.2，加水定容至1000mL ，添加800g 麸皮，拌匀至无干粉又无结团，分装入8~10个500mL 三角瓶中, 塞入8层纱布并包扎好。于121℃下灭菌30min ，趁热摇散，冷却至35℃备用。
麸曲培养基：取新鲜麸皮，用60目筛子筛去细粉，按麸皮:水＝1:1.0～1.3比例加水, 拌匀至无干粉又无结团，或用水洗麸皮表面，挤去水分至有水感而水不下滴为宜。上述麸皮装入500mL 三角瓶中，每瓶装80～100g 湿料，塞入8层纱布并包扎好。于121℃下灭菌30min ，趁热摇散，冷却至35℃备用。
④ 摇瓶发酵培养基
取细度为40目以上的薯干粉6～8g ，装入500mL 三角瓶中，再加入40mL 水和5个单位α-淀粉酶（中温）/g薯干粉，于75~80℃下液化15min ，瓶口塞入8层纱布包扎好，于110℃灭菌15~20min，冷却备用。
（5）玉米粉液化
取细度为60目以上的玉米粉300g 装入2000mL 烧杯中，加入1000mL 水和7~8个单位α-淀粉酶（高温）/g玉米粉，于80℃液化10min 后，继续加热至90℃保温30min ，碘检不变色后，再加热到100℃煮沸（5~10min），趁热经过二层纱布过滤，滤液加水冷却并调整糖度至15~20%和蛋白质含量不超过4g/L，取过滤清夜40mL 分别装入500mL 三角瓶中，瓶口塞入8层纱布包扎好，于121℃灭菌15~20min，冷却备用。
4、实验步骤及方法 （１）种子制备
①斜面种子制备 用接种环挑取冰箱保存的斜面菌种一环于斜面培养基上，于35℃恒温箱中培养3~5d，待长满大量黑色孢子后，即为活化的斜面种子。
②孢子悬浮液的制备 用无菌移液管吸取5mL 无菌水至黑曲霉斜面上，用接种环轻轻刮下孢子，装入含有玻璃球的三角瓶中，盖好塞子振荡数分钟。每支斜面的孢子悬浮液可接2~3瓶麸曲三角瓶。
③ 吸取孢子悬浮液2mL 接入上述麸曲种子培养基中，然后摊开纱布、扎好，并在掌心轻轻陪拍三角瓶，使孢子与培养基充分混合，于30~32℃下恒温培养1d 后，再次拍匀，于35℃下培养，每隔12~24h摇瓶一次，孢子长出后停止摇瓶，这样继续培养3~4d，即成种曲。
（２）摇瓶发酵培养
将麸曲孢子（或直接将斜面种子）接种于上述薯干粉或玉米粉的摇瓶发酵培养基中。接
种量：一支斜面接4~5瓶，一瓶麸曲孢子接20~35瓶。500mL 三角瓶装液量为40mL ，于转速为200r/min（24h 前为100r/min，24h 后为200r/min）、300r/min（24h 前为100r/min，24h 后为300r/min）旋转摇床上，35℃下培养3~4d。
（３）发酵过程检测
①发酵0h 、24h 、48h 、72h 、96h 分别各取下两瓶检测残糖、柠檬酸含量，以观察发酵过程中黑曲霉的耗糖与柠檬酸生成速率。
② 柠檬酸含量检测： 一般检测发酵过程中的总酸，采用0.1429mol/LNaOH溶液滴定
发酵过滤清夜 ③ 总糖及残糖(还原糖) 测定: 采用斐林试剂法。 5、 实验结果与记录
表 5-3 黑曲霉柠檬酸摇瓶液体发酵（24h 前为100r/min，24h 后为200r/min）
6、实验数据处理
（1）平均耗糖速率（g/h）：单位时间内黑曲霉消耗糖（还原糖）的克数。 （2）平均柠檬酸生成速率（g/h）：单位时间内黑曲霉生成柠檬酸的克数。 （3）糖酸转化率（％）：黑曲霉生成柠檬酸的克数与消耗糖（还原糖）的克数之比的百分数。
7、实验结果与讨论
（1）试以发酵时间为横座标，以糖消耗量、柠檬酸生成量、糖酸转化率为纵座标作图，
说明三者随发酵时间的变化，并加以分析。
（2）试比较表1与表2的结果，阐述通风量对柠檬酸发酵产酸的影响。 8．参考文献
（1） 王博彦、金其荣. 《发酵有机酸生产与应用手册》北京. 中国轻工业出版社.2000. （2） 罗大珍、林稚兰. 《现代微生物发酵及技术教程》 北京. 北京大学出版社.2006. 9．预习与思考题
请预习《发酵有机酸生产与应用手册》和《现代微生物发酵及技术教程》中柠檬酸发酵部分并思考：
（1） 柠檬酸发酵关键技术是哪些？
（2） 若要提高柠檬酸发酵产量和发酵的糖酸转化率，应再考虑设计哪些实验？