浮现的转基因生物发展和生物安全的思考
Jack A. Heinemann
新西兰坎特伯雷大学生物安全综合研究中心
摘要
在卡塔赫纳生物安全议定书起草的时候，基因是核酸以外物质的概念并不是谈判者脑海中最关注的问题。然而，早在十九世纪五十年代人们就了解一些遗传信息并不是仅限于议定书中核酸的DNA或RNA中。
通过正常的生物繁殖，细胞分裂或感染（例如病毒）携带遗传信息的其他物质，被称为外基因以区别基于DNA的基因。这些物质可以是小的分子，例如造成DNA和蛋白质可遗传模式的并且影响基因表达的甲基群，产物和生物效应均可遗传的小分子双链RNA，以及可以遗传的结构被称为淀粉样原纤维的大分子蛋白，并且这种结构或它形成中的媒介都有生物效应。
外基因操作是新出现的生成新型生物的一种方法，但是一些制定者认为这种操作超出议定书的范围，因此也是超出协调他们的行为一致于议定书的国内立法的范畴。例如，新西兰环境风险管理局(ERMA)发布了一条政策声明在新西兰有害物质和新物种法案(HSNO)范畴内接触特定种类体外修饰核酸（如RNA）的生物体不是转基因生物。
然而，RNA 被证实是遗传物质并且符合HSNO法案遗传元素定义，当然也符合议定书的定义。无争议的一个实例是一些病毒的基因组是由RNA构成的，对其进行修饰必须是在HSNO的范围内并且因而由ERMA调解。可以论证的是一些种类的RNA（比如双链RNA）或是自己扩增，或是转移某个特性到生物体中（比如改变基因表达的方式）或到生物体和其子代中，但是制定者否认这些案例在议定书或HSNO法案的范围内。
以新西兰作为一个案例来讨论所出现的制造转基因生物的技术意义。我认为双链RNA的利用应该明确的包含于议定书内，因为它符合议定书中现代生物技术字面的定义和条约的实质。其他的外基因离发展更远并且不符合议定书中现代生物技术的字面定义。除非所有参会人对什么构成了现代生物技术产品这一概念达成共识，否则一些开发者将通过与需要很少或不需要安全评价的国家合作得到商业利益，并且接受国可能会进口有潜力危害人类健康和环境的转基因生物而处于危险之中。
前言
什么是转基因生物？转基因生物通常被认为是现代生物技术的产物，塔卡赫纳生物安全议定书定义的概念特别规定了转基因生物的越界转移活动。现代生物技术是个狭小的技术范围，是描述从正常的生理学环境中取出基因并通过把这些基因重新放进活的生物体中生成产物（或病毒）的过程。这种转基因生物的后代还是转基因生物，即使是通过正常的繁殖，因为他们有父辈遗传的通过现代生物技术产生的基因。
议定书明确规定了核酸就是DNA和RNA。即便如此，一些制定者认为并不是所有的DNA和RNA的应用都被议定书管制。然而，基因的概念在变化并且不是所有的携带遗传信息的物质都可以严格的称为是核酸组成的。在卡塔赫纳生物安全议定书起草的时候，基因是核酸以外物质的概念并不是谈判者脑海中最关注的问题。然而，早在十九世纪五十年代人们就了解一些遗传信息并不是仅限于议定书中核酸的DNA或RNA中。(Heinemann and Roughan, 2000)。
通过正常的生物繁殖，细胞分裂或感染（例如病毒）携带遗传信息的其他物质，被称为外基因以区别基于DNA的基因。这种表达只是一种形式源于许多遗传学家认为的DNA主导的遗传。事实上，外基因在某种意义上就是基因，依靠该物质生物特性可以遗传，就像DNA一样。这些物质可以是小的分子，例如造成DNA和组蛋白类的蛋白质可遗传模式的甲基群，小分子双链RNA，以及可以遗传的结构被称为淀粉样原纤维的大分子蛋白。
但是外基因的操作在议定书的范围内么？我将会解释基因的概念及它和生物安全法规的关系。将会以新西兰的研究为例。
设定监管的环境
在新西兰，环境风险管理局规定了涉及基因修饰的行为。新西兰的法规与议定书一致。在2005年ERMA采取了一个政策把某些形式的调控RNA1看做是在HSNO法令范畴以外(ERMA, 2006)。调控性RNA分子从离体的DNA操作中分离，而DNA是生物体基因组稳定的一部分被认为是法案的范围内(p. 58 ERMA, 2006)，同时，调控性RNA分子源于体外合成或生物体提取，随后插入到另一个生物体中被认为是不属于HSNO法案的。排除后面一套导致RNA干扰方法的基本原理声明如下： 生物体的分子操作影响细胞内蛋白表达但没有改变生物体基因组。RNA干扰技术不能因此认为是HSNO法案下转基因生物的发展，因为宿主生物的基因并没有被改变，尽管公认的宿主的基因表达方式发生了改变(p. 58 ERMA, 2006)。
这个“基因组”的解释，是法案没有定义的一个条款，是不明确的，但是它起到了使某些种类的体外修饰的RNA，源于DNA修饰的RNA和无细胞体系合成的RNA免除风险评价的作用，并且和基因组作为全物质可以转移特征到其他生物和子代的普遍应用的条款相矛盾。这种ERMA在其政策中对RNA干扰有缺陷的描述(p. 57-58 ERMA, 2006)对其政策结论也有影响。当ERMA认为RNA干扰是由mRNA水平直接的正在进行的活动引发时，它忽视了从其他途径引起的重要的RNA干扰的可遗传途径，比如染色体的改变(Chong and Whitelaw, 2004, Lippman and Martienssen, 2004, Meister and Tuschl, 2004)。
在对这些问题与ERMA讨论时2，成员称他们认为存在即使是DNA的应用也没有生成转基因生物的案例。在这样的案例中，他们认为ERMA因此可能当其它的发展中利用明确的包含在法案（第二部分和1998年法规）中的同样的技术和分子时不要求开发商来寻求管制批准。
以上两个ERMA的解释中有相似之处。本报告阐述了现有的RNA的政策和一些DNA的应用不能生成一个转基因生物的相关事宜，并且考虑对于外基因管理什么政策是合适的，以及这些政策的意义。 HSNO 法案解析
当判断是否暴露于一种物质或一个物质和技术的组合会使生物成为转基因生物时，ERMA必须首先考虑在HSNO第二部分中GMO的定义：
任何生物的任何基因或其它物质：
(a).
(b). 通过体外技术修饰；或 继承或另外源于任何基因或体外技术修饰的其他遗传物质的许多复制
法案明确陈述了两个独立的试验，任何一个对于确定生物是转基因生物都是充分的（图1）。第一个试验只是要求生物获取了体外修饰的遗传物质[例如重组(r)DNA]。如果这些体外构建或派生的物质被认为是遗传物质，这个实验对调控性RNA和瞬间接触的DNA也适用（例如基因或其他物质）。ERMA的策略分析总负责人称ERMA任务是评价在HSNO法律框架下物质是否可以等价替换为“化学制品”。3
第二个试验包括了初始GMO的任何后代，所以任何转基因生物的后代都还是转基因生物(p. 43 ERMA, 2006)。有可能会想象（尽管这种假设很难证明）如果所有引起生物体可遗传修饰的分子和分子的作用在后代中丧失，那么子代便不是转基因生物。即使在这种假设的案例中，法案仍要求第一个生物隶属ERMA风险评价管理的范围。
HSNO ：一个参照物决定什么是转基因生物？
这个HSNO框架（由第二部分定义和1998年法规设定，“非转基因生物”）可以被认为是一个参照等级（图1），范围是从一个极端，DNA从一个生物体分离并通过任何一套可行的技术又插入到另一个生物体中，到另一个极端在遗传物质不会在自然的细胞、生理的范畴4释放的条件下整个生物体的或他们细胞的繁殖（例如组培繁殖）。高差异性种类的杂交，是包括在议定书的现代生物技术内的，是如此极端以至于“战胜了自然生理学繁殖或重组的障碍”。 1
2
3
4 例如，RNA干扰，反义，双链RNA介导的甲基化等等。 与ERMA成员的会议，2007年8月20日。 与ERMA成员的会议，2007年8月20日。 参照等级的参数在1998年HSNO（非转基因生物）中有描述。
图1的图示展示了框架结构并且为决策提供了清晰的界限。例如，生物体接受源自通过很多（细菌的）接合复制的rDNA，比起细菌接收通过插入已修饰的接合质粒到最初受体中转化生成的rDNA，并不是含糊不清的基因修饰。但是，导致DNA交换的细菌的接合，没有人类的干涉下已经有百万年的历史，是不在议定书范围内的。图1中间的盒子应该被认为决策者的数字开关，左边的遗传物质有体外5操作祖先来源并且右边的可以遗传的物质并不具有曾体外操作的遗传物质。
法案对于什么构成遗传物质是空白的，但是ERMA认为“遗传元素”等同于遗传物质
(ERMA, 2006)。法案定义的遗传元素是“生物体的任何基因，核酸或其他分子，没有人类的干涉，可以在生物体系中复制并且使一个性质或性状转移到另一个生物或生物的后代中” (Part 1 s2)。本人同意ERMA观点，遗传元素至少是个子集，如果不代表全套，而所有的可被认为是遗传物质。
有这样的框架在脑海中，问题变成RNA和DNA什么时候是遗传物质？相关的问题是什么时候生物成为RNA的转基因生物？
这些问题按照RNA的应用考虑的话ERMA认为不生成转基因生物(ERMA, 2006)，并且DNA的应用ERMA认为可能不会管制6。因为ERMA必须在法案内操作，笔者争论的是：
1. RNA和DNA明确地在法案的范围内，并且
2. 考虑任何分子被认为在任何环境中是遗传物质需要向ERMA申请缺少适当的预警观点。然后该是
ERMA考虑遗传物质是否通过受体或并发的水平转移导致风险并确保其应用的管理。
源于RNA应用的转基因生物
这部分我将说明遗传元素例如RNA分子的明确的排斥在管制之外(in ERMA, 2006)，并且DNA通过非正式的ERMA程序被潜在的排斥在规则之外，是应该被调节的。原因如下：
• RNA不只是个化学物。它是一个核苷酸，在一系列的生理的和技术的应用上等同于DNA的遗传
物质和遗传元素。
5 体外操作意思是一切从正常的状态和环境中提取遗传物质进行核苷酸酶化重组就像通过限制 与ERMA成员的会议，2007年8月20日。 酶或其他技术。 6
• 一些RNA分子转移性状到生物中，该性状的遗传可以通过RNA复制或其他遗传物质的复制。 • ERMA认可调节导致可遗传变化的其他遗传元素的需要（例如朊病毒），甚至这些变化不是因为
特定核苷酸的长久存在而导致的。
RNA的可遗传性充分证明它是遗传物质
RNA是DNA高度相似的核苷酸。它可以是一些遗传物质/生物的基因组，比如病毒。RNA分子在这些病毒中是基因正如在其他遗传物质和生物中的DNA构成的基因一样。RNA有别于化学物质是因为它在这个范畴内有遗传性。遗传性的证明或是通过RNA跨代传递（例如病毒的子代）或是传染性的传递一些性状（比如病毒感染细胞器的例子）。
在RNA-和逆转录病毒的案例中，病毒是通过一种被称为聚合酶的酶，依靠现有的RNA（RNA病毒）或DNA（逆转录病毒）分子作为共同作用因子的酶反应被扩增、复制、繁殖的。这些反应和依靠这些相同或相似RNA聚合酶产生其他RNA分子的反应并没有多少不同。
以上的讨论指出不同水平RNA“非遗传物质”和“遗传物质”界限不能清楚划出。RNA是遗传物质，只要它参与无论是自身复制的工具还是感染的或跨代的性状转移的原因的过程，正如遗传元素定义指出的一样。
RNA干扰是遗传元素引发的一个特征或性状
通常来说，当一个分子（例如DNA）在生物体系中既是一系列的生物化学反应共同作用因子又是反应产物时，它的操作既可以认为是基因又可以是外基因（图2）。DNA合成利用一条链为共同作用因子并且自由的核苷酸为前体。相似的，朊病毒复制的前体是翻译反应提供的。RNA干扰，由dsRNA分子诱导，是一个有时遗传有时自我复制的现象。RNA干扰的特征是由他们自身合成相关的物质决定的。
RNA干扰是最近发现的基因沉默的一个机制，可在生物界所有生物中发生。涉及的RNA分子被称为，很多种类，双链分子RNA(Denli and Hannon, 2003)，小干扰RNA(siRNAs)，重复联合小干扰RNA (rasiRNAs)，微RNA(miRNAs) (Meister and Tuschl, 2004)以及小发卡(sh)RNA(Paddison et al., 2002)，导致了RNA干扰，RNA沉默，抑制，共抑制，枫浆尿病，协同抑制和转录后基因沉默(PTGS)(Chandler and Vaucheret, 2001)，甚至副突变现象(Ashe and Whitelaw, 2007)的发生。双链RNA介导的沉默复制的前体是由转录反应提供的并且双链RNA为共同作用因子。
RNA干扰作为基因修饰技术很快被采用，使得这种技术更多更广泛的用于构建和传递dsRNA载体（成为RNA干扰的代理）。dsRNA本身可以成为载体因为它比DNA更可以水平的移动（讨论如下）。
复制被认为是物质作为基因的一个重要属性而不是化学物质的本质所现。与外基因说明一致，ERMA正确的应用朊病毒来争论“复制”对于遗传元素更广泛的定义。
“考虑复制这个词权威人士已经采用了一个广泛的定义就是包括‘可以被复制’同样可以‘复制自己’” (p. 44 ERMA, 2006)。
严格的理解，没有比细胞更小的有能力进行自我复制的生物，因为即使DNA也是一系列生物化学反应的产物，反应里它是一个共同作用因子和反应产物（图2）。然而，DNA通常被描述为自我复制，意思是确保这个分子可复制的基础构造是十分可靠的以至认为像议定书定义的那样在所有生物中DNA组成的所有基因都可以复制。
由于RNA成为遗传物质或遗传元素，可以直接推论接受有遗传历史的源于体外操作的RNA或是体外操作的有遗传历史的DNA合成的RNA，都是基因修饰。
遗传物质和化学物质的区别在于前者可以自我扩增。扩增被视为跨代遗传或感染的先决条件。相反，化学物质在扩增途径上并不是作为共同作用因子直接参与的。当RNA和一些抗生素（如利福平）都可以改变基因表达方式时，前者和后者不同在于它可以被复制同样自我复制。RNA
可以扩增在某种意义上是“可
以被复制”，同样RNA可以使性质和特性转移在某种意义上是“自我复制”，这点双链RNA介导的DNA和组蛋白重甲基化可以证明。RNA干扰有时可以显示双链RNA担当遗传物质。决定与生物化学途径，RNA干扰有时归于“可被复制”，有时归于“自我复制”的原理是：
• 感染转移：“干扰活动可以跨越细胞界限„RNA在内脏中吸收并且从肠道分散到体组织和微生物
菌株是可以发生的” (Tabara et al., 1998)。
• 跨代转移：RNA干扰的作用是长远的。有效的干扰不只是在被注射的动物中同样在被注射的动物
的后代中可以观察到。尽管，干扰可以遗传„对于很多基因，干扰在注射后可以持续一整代，对于某些基因，干扰被发现在种系间的转移有明显的不确定性(Tabara et al., 1998)。
ERMA 明确的否决这类RNA是遗传物质
“已经被生产和纯化的小干扰RNA，反义RNA，小发卡RNA，微RNA和双链RNA不是遗传物质 ” (p. 58 ERMA, 2006)。
但是，按照法令的定义双链RNA显然是一个遗传元素所以不能被ERMA政策排斥在外。
通过不同生化途径的双链RNA的复制和RNA干扰的遗传
复制双链RNA分子的能力几乎是普遍的。“转录后沉默/RNA干扰最先的报道见于植物中，但是后来RNA干扰相关的事件几乎在所有真核生物中发现，包括原生动物、果蝇、线虫、昆虫、寄生虫、鼠和人类的细胞中” (p. 657 Agrawal et al., 2003)并且也在细菌中发现(Gottesman, 2005, Tchurikov et al., 2000)。尽管理论上许多生物感染双链RNA将有能力复制并且表达RNA干扰的性状，就像他们可以复制DNA和潜在表达DNA介导的性状一样，决定于遇到的特定条件。例如，DNA基因表达需要不同调节序列和转录和翻译因子的兼容。同样的，RNA干扰需要现有基因和首先进入细胞的小的双链RNA分子的兼容(Buratowksi and Moazed, 2005)。
一旦这些条件达到， RNA干扰由“单链互补RNA翻译的抑制或分裂引发，就像信使RNAs或 病毒基因组/反基因组RNAs 。这小的RNAs同样被用于引导染色体修饰”，DNA甲基化，组蛋白修饰，后者可以通过单独的途径遗传(see Chong and Whitelaw, 2004, Lippman and Martienssen, 2004, quote from p. 343 of Meister and Tuschl, 2004)。
RNA干扰/转录后基因沉默作为外基因现象的划分很大程度决定于在基因表达时产生可遗传变化的能力。沉默遗传不外乎两个来源。第一个是信号的持续。第二个是沉默状态的持续(p. 1516 Bernstein et al., 2001)。当双链RNA进入一个通过序列特异性降解和RNA依靠得RNA聚合酶扩增的自我复制途径时，性状决定于信号的繁殖（例如双链RNA）。这个发生的一条途径是通过“转基因稳定的结合入基因组，出现的内生的重复元素例如转座子，或强制表达的发卡RNAs。这些案例不需要额外的机理来解释遗传沉默因为起因是一个内生的遗传元素的表达产物” (p. 1516 Bernstein et al., 2001)。ERMA已经曾任的一个案例中，作者认为“遗传元素”是DNA。后者是更具煽动性并且需要考虑其独立于沉默起因的繁殖信号或是沉默状态的机制(p. 1516 Bernstein et al., 2001)。我认为这个案例应该被ERMA和议定书代表方关注。
许多类型的诱导事件导致RNA干扰，包括：体外合成双链RNA，一个新型的mRNA前体（如转基因引起的，一个DNA插入产生的新的编码框，或新的内含子），或正常不会发生的一个细胞类型或时间的转录产物的表达，正如激活一个区域的异染色质DNA所发生的(Denli and Hannon, 2003, Grewal and Elgin, 2007)。如果内生RNA编辑途径作用于对一外源RNA底物双链RNA将会产生。 (Heinemann and Bungard, 2005, Yang et al., 2006)。
开始的反应只需要普通的启动子或是其他类型的调解元件作用于两个不同的基因或“异常的RNA” (Al-Kaff et al., 2000, Bhullar et al., 2003, Heinemann, 2007b, Herr et al., 2006)。尽管，当两个不同的转基因由共同的通过体外环境培育而结合启动子操作时，一个新型的双链RNA可以出现，或当一个病毒，例如CaMV，带有原始的启动子，普遍存在的35S启动子，去感染转基因植株。“转基因RNA将会明显的倾向于反常，„尤其当他们没有植物来源元素时，因为他们可能没有十分精确的结构，这些结构对于有效的与
多数细胞mRNA相关的完全互补的mRNA结合蛋白相互作用是必需的。另外，如果转录过早或过晚，将会产生完全异常的RNA。过早或过晚的终止转基因的转录可能是由转基因DNA或RNA的构造的特征决定的，或是正如许多年前所示，由转录区域内的DNA甲基化决定” (p. 14999 Herr et al., 2006)。
这里有许多信号扩大和信号具有转染力的例子。“我们的研究证明这个设想，小干扰RNA自身或由其诱导的中间体可以产生信号抑制并且可以自我扩增的模式生成” (p. 11981 Klahre et al., 2002)。“显而易见的，RNA沉默可以从植物的一个区域传递到另一个区域，并且RdRP被认为在这样“沉默扩散”中起作用”(p. 464 Tang and Galili, 2004)。最令人信服的信号放大的机制涉及双链RNA分子的再生或是源自现有的双链RNA分子新的转录目标，或是RdRP开始扩增(Mello and Conte Jr., 2004)。
注入雌雄同体线虫的双链RNA产生的RNA干扰可以稳定遗传到F2代显示双链RNA显示催化作用并且/或被细胞内蛋白复制。由双链RNA注射到线虫肠道或是通过喂养表达双链RNA的细菌给线虫而引发的RNA干扰与直接注射到株系中效果一样，显示与植物中基因沉默一样RNA干扰可以从细胞到细胞进行传递。 (p. 639 Cogoni and Macino, 2000)。以上描述的动物被双链RNA而不是DNA的感染，通过自身的细胞传递沉默特征到下两代中，尽管这些案例的后代中存在特征退化(Bernstein et al., 2001)，并且从而这个物质传递“一个特征或性状到„生物的后代” (HSNO s2)。
RNA干扰和相关的现象符合遗传物质决定的性状的描述。这些形状决定于DNA的甲基化，染色体的修饰或小的双链RNA分子持续的产生，所有这些都构成了性状不同的复制途径(Matzke and Birchler, 2005)。在这三个案例中，有证据显示负责促使RNA干扰途径的DNA不是感染传播或遗传所必需的。因此不同种的双链RNA可以是一个外基因的关键部件是没有问题的，或是部分通过直接的双链RNA的复制而繁殖或是间接的通过包括双链RNA分子的途径持续。
我认为这些发现与“被用于生产和纯化的双链RNA分子不是遗传物质” (p. 58 ERMA, 2006)的政策是矛盾的。
两种方式的RNA应该被认为是遗传物质。第一，它无疑是一些病毒的基因组。第二，由普通的酶式反应产生的RNA分子在一些生物体或环境中证实了特征或性状的感染或传递到子代的能力。
RNA和DNA具有同样的操作技术
应用双链RNA生成的转基因生物与用DNA生成转基因生物的方式一样(e.g. see list on p. 38-39 of ERMA, 2006)。一个特殊生物体的双链RNA被确认或合成，纯化并通过一些方法传递到另一个生物，然后受体被转化。双链RNA“转化”成功利用的基因枪和基因注射的技术(Agrawal et al., 2003, Kusaba, 2004)。至少在一些动物中它可以通过食物或动物放置在缓冲液和双链RNA的池中利用表皮细胞来吸收。(Agrawal et al., 2003)。
RNA干扰可以有组织的在植物和动物中传递(Klahre et al., 2002)。这是由植物中双链RNA决定的性状与DNA分离流动进入到移植受体中证明的(Vaucheret et al., 2001)。这在动物中利用线虫饲养表达双链RNA的细菌（图3）或是吸收双链RNA(Fire et al., 1998)证明。双链RNA介导的沉默可以由病毒介导的转染/转化诱导产生(Shen et al., 2003)。
DNA是遗传物质但不是一直“可遗传的”
转基因生物本质上不是由表型变化定义的，同样不是由原始修饰物质的保持力决定。转基因生物必须只是发生了体外操作的源于祖先的核苷酸的变化。
当DNA序列不隔代遗传时可能遗传的改变一个受体，例如通过改变蛋白表达的模式。实例遍布可从瞬时转化/转染载体的应用到细菌相变异(Tam et al., 2005)。用一个已经熟悉的例子说明，想象一个编码类似朊病毒的组成蛋白的等位基因通过瞬时转染进入到受体中（利用假定的DNA载体不能复制并且不能重组
7）。等位的DNA可能消失，但是朊病毒可以通过自身复制长久存在并且可能通过传染转移(ERMA, 2006)
另一个案例在细菌遗传学中常见。用DNA瞬时转化的细菌编码可能作用于转座子转位酶，导致没有在后代中传递(Caughey and Baron, 2006, Prusiner, 1998, Weissman et al., 2002, Weld and Heinemann, 2002) 8。 保持力的转位酶的应用和重新插入(used by Cooper and Heinemann, 2000, Heinemann et al., 1996)。更详尽的说明来自一个转基因玉米作物LY038。这个作物是由Cre重组酶作用于loxP位点瞬时表达产生的并且导致可以遗传的DNA缺失。即使当DNA删除不是这个结果，Cre可以导致染色体不稳定和重排(Qin et al., 1994)。这个例子基于转基因生物，它来源于一个自然的重组酶系统。这个系统应该立即引起ERMA注意因为它正在成为一个生成转基因作物的常用方法(Ow, 2007)。最终观点是这个例子证实转基因的切除，通过重组酶作用或其它事件，并不能使生成的生物为非转基因生物。因为生物的基因或其他物质被原始的rDNA所修饰。
在以上的例子中，rDNA复制或重组的潜力伴随着基因修饰的风险评价。ERMA发布同样的结论声明：“看起来立法者有意定义遗传物质，反对可遗传的物质，是要包括任何核苷酸而无视它是否可以起作用。这种转化的作用被考虑到申请的评估中” (p. 44 ERMA, 2006)而不是在申请必要性的评估中9。
在议定书中建立风险评估需要时遗传性是充分的但不是必需的，接受改造的核苷酸足够得出一个生物是转基因的结论。
RNA是遗传物质但不是一直“可遗传的”
如以上所诉DNA可能改变生物的基因或其他物质而不被遗传。没有理由推论这个只是DNA的特性。许多上述的例子如果再插入mRNA分子替代DNA分子同样可以发生。因此所有的受到RNA修饰的生物都应该认为是转基因生物并且需要ERMA的风险评价(p. 44 ERMA, 2006)。但是，体外合成双链RNA的应用，或双链RNA从生物体的分离以及随后重插入到受体生物中，如果坚持它的政策大概将不会被归入ERMA疏忽的范畴(ERMA, 2006)。这样一来，政策使得RNA的应用明显区别于同样处理得DNA的应用。可以这么做的途径只有假设：1.RNA不是遗传物质，2.RNA干扰不是可遗传的特征或性状，并且/或3.刺激性双链RNA，扩增或持续，或染色体修饰/DNA/组蛋白甲基化维持效果，都不是复制的产物。如上所述，没有一个假设是合理的并且它们在规则中不具一致性或预防性。
建议：
RNA应用对实验室研究和发展有潜力的商业化产品是十分重要的技术： 7
8这个假设的受体是ERMA成员在8月20日会上作为一个例子提出的。 我并不认为这是个特殊的案例有至少两个原因。第一，什么样的蛋白可以变成朊病毒是未知的，而朊病毒可以在许多生物中存在是已知的。第二，这是其中一个可能表观遗传的特性或特征并且不是依靠与一个刺激核酸的稳定的遗传/复制(Heinemann, J. A. and Roughan, P. D. (2000). New hypotheses on the material nature of horizontally transferred genes. Ann. New York Acad. Sci. 906, 169-186. Strohman, R. C. (1997). The coming Kuhnian revolution in biology. Nature Biotech. 15, 194-200. Weld, R. and Heinemann, J. A. (2002). Horizontal transfer of proteins between species: part of the big picture or just a genetic vignette? In Horizontal Gene Transfer, C. I. Kado, and M. Syvanen, eds. (London and San Diego, Academic Press), pp. 51-62.)转基因植物田间试验检测水平基因转移的问题
9 然而，我不认为ERMA或许多申请者可以证明有很少或没有复制或重组会长久的不相关。复制可能效率太低以至最终会丢失DNA，所有或部分处理的遗传物质的重组不能被阻止。这是“按摩方式”重组的成果. (Heinemann, J. A. and Traavik, T. (2004). Problems in monitoring horizontal gene transfer in field trials of transgenic plants. Nat. Biotechnol. 22, 1105-1109.) 大多时间DNA复制的效率足够低以至可以逃出检测，但是仍然导致了DNA持续性 (Srivastava, V. and Ow, D. W. (2003). Rare instances of Cre-mediated deletion product maintained in transgenic wheat. Pl. Mol. Biol. 52, 661-668.)
在中国，研究者种植产生抗病毒双链RNA的烟草。这种双链RNA沉默病毒基因其转染人体
细胞要优先与病毒转染(Zhou et al., 2004)。
在美国的Whitehead，研究者发现一种方法可以有效的包裹小鼠的cDNA文库到反转录病毒
（有RNA基因组）中来潜在的沉默小鼠基因组中的每个基因(Luo et al., 2004)。
最近，Xiang等改造大肠杆菌制作了一个对人类细胞特效的双链RNA分子（移植到模式小鼠
的肠道中）并且显示小鼠摄取的和细菌吸入细胞的对于诱导基因沉默是足够的，推测不需要
DNA的转化(Xiang et al., 2006)。这个方法与任何非复制型DNA载体的应用相似，为了双链
RNA初始插入并随后在内生RNA干扰途径使得质粒消失后进行繁殖，可能是通过染色体的
修饰。
转基因抗病毒木瓜可能就是基于RNA沉默但是涉及了rDNA的应用(Latham and Wilson,
2008)。
更多的理论出现在文献中。例如在香蕉或西红柿中表达抗艾滋病病毒的双链RNA被建议作为人类口服的疫苗(Brisibe et al., 2003)。最决定性论证外基因操作是生物技术工业的目标来自两篇文章，一个是孟山都的科学家，研发作为杀虫剂的双链RNA而不使用rDNA(Baum et al., 2007, Mao et al., 2007)。
研究者发现植物中产生的双链RNA可以通过食物传递到昆虫肠道细胞中，并且随后分布于整个动物体(Gordon and Waterhouse, 2007)。不考虑是否双链RNA是设计出的还是偶然的存在于转基因植物中，很显然它具有十分重要的生物影响。文献确定无疑的认为重组或合成来源的RNA不能是“被认为是安全的”，必须被测试或证明是安全的。
有趣的是，转基因种子开发商孟山都已经预先声明RNA“被认为是安全的(GRAS)，次级RNA转录产物„的存在本身不会引起安全问题” (MSL-17632., 2002)。然而，转基因双链RNA杀虫剂植物产生的双链RNA事实上是派生的或次级RNA种类，并且显然孟山都的Baum等认为他们是RNA干扰在目标昆虫中发生后更多的派生RNA分子的起因。这些发现对公司和政策制定者提供了强有力的论据，由先前解除转基因作物对人类健康和环境安全评价中转录和翻译分析，变为现在接受如此询问的重要性(Heinemann, 2007a)。
不是所有可以通过转基因转录形成的双链RNA分子是可以预测的，甚至是被识别了的和描述了作用的也不一定可以预言。如果所有双链RNA作用是独特的那将有所不同，或是所有脱靶效应危害可以直接通过已知的双链RNA序列或通过RNA干扰途径可能随后生成的其他双链RNA分子被直接预计出。但是，目前没有办法预测所有的脱靶效应。
首先，这是因为小干扰RNAs引起的基因沉默对小干扰RNA是特异的，而不是小干扰RNAs对于目标基因是特异的(Jackson et al., 2003)。有时许多的脱靶转录减少或沉默(Jackson et al., 2003, Jackson et al., 2006, Ma et al., 2006)。例如Semizarow等发现一系列5个不同的沉默同一个基因(AKT1)的双链RNA分子共同的沉默840个基因(Semizarov et al., 2003)。RNA编辑中种类特异的不同更长远的贡献于不可预料的双链RNA种类和脱靶效应(O'Connell and Keegan, 2006)。所以，转基因作物转录分析需要对所有新的双链RNAs进行评价。因此，由于脱靶效应有时只改变蛋白水平而不是转录水平(Jackson and Linsley, 2004, Scacheri et al., 2004)，所以转基因作物饲养动物的转录和翻译都需要剖析。
其次，源于昆虫转录过程中的双链RNA分子没有关于非目标捕食昆虫或食物链的其他水平的有关脱靶效应鉴别或测试。例如，Baum等注意到“基因沉默和幼虫致死需要的小量的双链RNA显示了吸收的双链RNAs加工成小干扰RNAs过程中的放大效应，推测在昆虫肠道上皮细胞中，可能为更多的次级小干扰RNAs合成提供基础”双链RNA对于什么范围的基因可以产生RNA干扰响应？它是否会通过可能捕食昆虫的动物而传递？它是否会传递给人类通过可能食用部分甚至污染的加工的动物食品((e.g. Ref Thind and Clarke, 2001))？
这些问题对于转基因作物同样很普遍因为转基因的构造允许自然中不存在的或对转基因植物不是特有浓度的双链RNA分子生成的机会，所以被排除在食用转基因植物的生物之外，包括野生动物和人类。商业化的转基因是个复杂的实体，由源于八种不同种类的DNA元素构成(Rommens et al., 2004)。比如说在Baum等构造中，不考虑背景载体的话，由源于病毒、玉米、昆虫、小麦的DNA构成。商业的转基因通常在较
高水平表达，造成一些双链RNA上调的生物学水平的潜力。在随后的解释中，Gordon 和Waterhouse发现“包括喂养昆虫的RNA干扰分子很可能是长的发卡RNA——不是通过植物DCL酶正常的生成小干扰RNA派生物”(Gordon and Waterhouse, 2007)。同样值得注意的，推测以前败于产生双链RNA杀虫剂功效可以归结于转基因植物生成发卡RNA的几率远远高于in-planta产生的。
最终，不只是双链RNA杀虫剂植物还有双链RNA昆虫都是可论证的转基因生物，因为双链RNA是重组技术分离出的核酸，并且显然它转入到昆虫并且作为遗传物质使用来达到预期的杀虫效果。直到有其他证明，可以假定动物食入在目标昆虫中生成的双链RNA将同样被潜在的转化，并在议定书的覆盖范围。相似地，认为甚至加工的植物源产品都可能被转基因昆虫污染是合理的，所以目标昆虫应该被介入到管理和预防当局食品安全评价的范畴。
双链RNA杀虫剂植物尤其重要的是他们证明植物组织和昆虫肠道中双链RNA的稳定性，双链RNA潜在的能力使昆虫细胞转化成新的稳定的基因表达模式，并且这个案例中他们证明了一些食用的双链RNA潜在的毒性。
结论
综上所诉，很明显RNA明确的属于通过体外修饰可以生成转基因作物的物质，正如HSNO法令和议定书中LMO定义一样。如果议定书中的国家制定者不同意，我相信他们会鼓吹改变议定书中这个非谈判者本意的明显的漏洞。
所有体外核酸或其他遗传物质操作的生物的修饰都应该在议定书的权限之内。通过这些考虑得出的结论如下：
1. RNA和DNA都是核酸，不应该有时被认为是遗传物质而有时认为不是；
2. RNA和DNA可以产生遗传效应不管RNA或DNA是否可以自我复制（如阮病毒和RNA干扰解
释的一样）；
3. 表观遗传学是一个新兴学科带有很多不确定性，按照议定书预防的姿态，所有的基因或其他物质
通过外基因可以呈现自身的应用都应归入调节之中。
尽管我认为议定书显然应该适用于dsRNA，但很不情愿这样做，至少有一个谈判方建议，其他由外基因操作产生的LMO不会在适当的风险评估中在所有国家都自动获益，因此可能不会通知接受国。对于所有谈判方而言，这都是一个受关注的问题，在它作为一个贸易上的优势得到利用前各国应该试图弥补这个法律漏洞。
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