第20卷第6期2001年 12月华 中 农 业 大 学 学 报
JournalofHuazhongAgriculturalUniversityVol.20 No.6Dec.2001,584~592
基因克隆技术
周国岭 杨光圣 傅廷栋
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉430070)
摘要 综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或T2DNA标签法、同源序列法、表达序列标签
(EST)法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。
关键词 基因克隆;图位克隆;转座子标签;T2DNA标签;同源序列;EST;差异表达基因中图法分类号 Q785
人类基因组计划(HGP)的迅速进展及几种模质的分离纯化技术,在大部分基因产物的结构功能
式生物基因组测序的相继完成为人类提供了大量的未知的情况下,基因组信息,这已成为人类探索生命奥秘的入手点,破。近年来,反向遗传学()的建立,同时也为后基因组时代提供了更富有挑战性的任务。基因组学时代的主要任务是图谱制作和序列测路定,后基因组学时代则是进行基因组功能注释
(map2basedcloning
(genomeannotation),研究目标[1,2]。cloning务, 随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越),改良农作来越多的基因被定位,90年代初,图位克隆技术也物、畜禽品种等应运而生。其基本工作思路为:首先将目的基因精疗,探索疾病的分子机制和生物发育调控规律。由确定位在分子标记连锁图上,利用与目的基因紧密于基因组计划要耗费大量人力、物力、财力,所以并连锁的标记筛选大片段DNA文库(如YAC、BAC、非每一种生物都可以拿来测序,而且模式生物的基TAC、PAC或cosmid文库),并构建含目的基因区域因有时并不能直接用于其它生物,因而克隆其它生的精细物理图谱,利用该物理图谱采用染色体步行物中对人类有益的基因也变得日益重要。随着基因(chromosomewalking)的方法逐步逼近目的基因(如专利权的建立和完善,基因争夺大战的硝烟日益弥人的NPC1基因的克隆[4]和拟南芥的WIGGUM漫全球,克隆基因似乎有着一本万利的诱惑力。在基因的克隆[5])。若侧翼标记与目的基因连锁十分这样一个大环境下,克隆基因的技术也随着分子生物学发展的步伐而日臻完善和多样化。在传统遗传学(正向遗传学)占主导地位的时代,人们以基因产物为导向来分离克隆基因(功能克隆)。由于基因产物的结构、功能已知,可通过分析部分多肽或末端氨
紧密或共分离,无需步移就可直接着陆,获得含目的
基因的大片段克隆,再将大片段克隆作亚克隆分析或用大片段克隆作探针筛选cDNA文库,从而将目的基因确定于1个较小的DNA片段上,进一步作序列分析和目的基因功能鉴定。基因组DNABAC
)
基酸序列,反推其核苷酸序列,设计探针或引物从基或PAC克隆末端序列的分离是图位克隆中很重要因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆(如玉米的一步,Yang等利用BAC或PAC载体的特有酶切组蛋白脱乙酰酶HD2基因的分离[3]),也可以制备位点NotⅠ或SfiⅠ和BAC片段内的多酶切位点产物抗体,从表达载体构建的cDNA文库中筛选相(EcoRⅴ、HpaⅠ、StuⅠ、XmnⅠ)进行应克隆,进而分离目的基因。功能克隆受限于蛋白双酶切,然后与质粒载体连接,进行锚定PCR来分
收稿日期:2001205204
周国岭,女,1978年生,华中农业大学农学系在读硕士生.武汉430070
第6期周国岭等:基因克隆技术 585
离BAC的长末端序列[6],发展了一种高效快速的方仅局限应用在人类、
拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和法。图位克隆法首先被应用于模式植物拟南芥生物上。随着比较基因组学的发展,人们意识到要(Arabidopsisthaliana),1992年Giraudat等成功分充分利用图谱饱和生物的遗传信息服务于其它生离了与拟南芥种子形成和发芽相关的脱落酸信号传物。我们可以利用同科异种间染色体共线性或同线导基因ABI3[7],Arondel等则分离到拟南芥的ω-3性,通过比较基因组分析和染色体着陆,将控制该物脂肪酸脱饱和酶基因FAD3[8]。由于抗性性状的遗传行为简单,表型易鉴定,而人的遗传性疾病也有这个特点且人类高密度的分子标记连锁图已建立,所以图位克隆技术在分离植物抗性基因和与人的遗传性疾病相关的基因上取得了很大的成功。如番茄抗霜霉病基因Pto[9]、水稻抗白叶枯病基因Xa21[10]、小麦抗线虫基因Cre3[11]及200多个与人遗传性疾病相关基因的克隆等。
利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库,建立饱和的分子标记连锁图和完善的
种有关性状的基因或分子标记直接定位在它的分子标记连锁图中。如利用小麦与水稻基因组间的同线性,Sarma等将小麦控制开花时间的基因(Vrn)和控制谷粒硬度的基因(Ha)定位在第5组染色体上[12]。通过大鼠与人的比较基因组分析,Scharf等定位了SMA的一个候选修饰基因H4F5[13]。这些进展不仅为更快捷地克隆基因创造了条件,而且拓宽了图位克隆法的应用范围。已有人开始利用水稻的图谱信息筛选水稻小麦同线区的BAC或YAC,用于测序以搜索候选基因[12遗传转化体系,而且还要进行大量的测序工作,所以的Q,也使人们有对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采QTL来改用此法不仅投资大,而且效率低。因而图位克隆法。
利用的转座子系统有:Ac/Ds、En/Spm、Mutator等,
2 转座子或T2DNA标签法(transpo2其中以Ac/Ds双因子系统利用最多。Johal和sonorT2DNAtaggingmethod)Bridgs利用转座子标签法克隆到玉米抗圆斑病基因
HML[15],这是第1个克隆的功能产物未知的植物
同源或异源的转座子或T2DNA可以插入到基
抗病基因。Jones等利用Ac/Ds系统克隆了番茄抗
因组中导致基因结构的变化,从而产生突变基因型。
叶霉病的基因Cf29[16],Aarts等利用En/Spm系统
从1987年Feldman等将T2DNA作为一种基因标签
克隆了拟南芥的1个雄性不育基因[17],Cui等利用[14]
来筛选突变体以来,迄今为止在植物上已获得了
Mutator转座子克隆了玉米T2胞质1个核恢复基因
拟南芥、番茄、玉米、水稻、金鱼草等的转座子插入诱[18]
rf2。1990年Yanofsky等利用T2DNA标签法
变和拟南芥等T-DNA插入诱变的突变群体,从而克隆到1个调节花器官(柱头和雄蕊)发育基因的转为克隆基因创造了条件。此法的基本程序为:首先录因子的基因AG[19]。1999年Puzio等则用T2进行突变体的诱变和鉴定工作,然后以转座子或T2DNA标签法从拟南芥中分离到1个与抗线虫有关DNA作为标签DNA制成探针或引物,筛选突变体的基因[20]。基因组文库,用反义PCR(IPCR)技术分离出标签由于有些植物存在内源转座子,像金鱼草、玉DNA两侧目的基因部分序列,再依据序列设计探针米、拟南芥,因而利用和植物本身同源的转座子转座或引物筛选野生型基因组文库,即可分离出完整的就不能区分真正标签基因的转座子,所以转座子标基因,最后用基因互补测验检测其功能。在植物中签多用异源植物。另外大多数转座子转座频率不
586 华中农业大学学报第20卷
高,拷贝数过多,导致诱变频率很低,这使大多数植物很难获得转座子突变体,而且亲本之一必须含有转座子或要通过转基因或杂交进行转座子引入,从而限制了它的应用。而对于那些要在特定环境或特定发育阶段才能有突变表型的基因,往往由于看不到明显的突变表型而被忽略,大基因组中以基因家族形式存在的基因,由于基因的功能补偿,若1个或一部分基因家族成员发生了插入突变,也可能看不到突变表型,因而转座子或T-DNA标签仅限于分离克隆那些有明显插入突变表型的基因。鉴于此,现在又发展了一种转座子捕捉(transposontraps)[21]
子捕捉和基因捕捉2种类型。
由于DNA测序技术飞速发展,大量的基因序列信息展现在人们面前,新的未知功能的基因不断被发现,利用转座子或T-DNA标签鉴定基因的生物学功能得到越来越广泛的应用。但它的一个突出问题是要进行大量突变体的筛选[22,23],以前所用的PCR[24,25]虽然很容易鉴定突变体,但要对数以千计的材料进行PCR,工作量仍很大。1998年Winkler等采用DNA混合池和杂交策略进行突变体筛选[26],大大减少了PCR次数,从而使工作量减轻很
多。另外要对如此之多的突变体进行生产繁殖也是
的手段来捕捉那些无表型突变的基因,包括有增强一件花费人力物力的事
。
3 (can2didate设计简并引物扩增植物DNA文库,从获得的抗性克隆中找到了一些新的抗性侯选基因[27,28,29]。Pavesi等根据谷氨酸脱氢酶基因(GDH)结构中某
,人们发现几些序列在物种中的保守性设计简并引物进行RT-乎所有的基因与其它的基因都有一定的联系。人们PCR,利用扩增产物制备探针筛选龙须菜cDNA文将功能相似来自相同始祖的基因归为一个家族,基库,得到GDH的全长cDNA[30]。对于同源性很高因家族的成员往往成簇存在,几个基因家族组成一的基因,可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选个超基因家族,超基因家族各成员之间既有高度同另一物种的DNA文库。如Gao等用豌豆淀粉合成
)的cDNA作探针筛选小麦的cDNA源区域,也有高度趋异区域,如原癌基因(onco2酶基因(SSⅡ
gene)、同源异型(homeotic)基因、肌球蛋白(myosin)文库,得到小麦SSⅡa的cDNA[31]。Funkenstein基因等。人们根据基因家族成员所编码的蛋白质结等用红海鲷和红鳟鱼的生长激素(GH)基因的cD2构中具有保守氨基酸序列的特点,发展了一条快捷NA筛选gsb的cDNA文库,得到gsbGH的cDNA克隆基因家族成员的新途径———基于同源序列的侯克隆[32]。Almuly等用gsbGH的cDNA筛选gsb的选基因法。其基本思路为:首先根据基因家族各成基因组文库,进一步克隆了gsbGH基因[33]。员间保守氨基酸序列设计简并引物,并用简并引物该方法自提出以来,引起了国内外学者的广泛对含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增,再对重视,发展很迅速,但有些问题是值得重视和思考PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。如植物的:①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源抗病基因具有以下保守氨基酸序列:核苷酸结合位程度的差异,简并引物的特异性要设计得当。②由点(nucleotidebindingsite,NBS),富亮氨酸重复序于某些同源序列并不专属于某一基因家族,因而扩列(leucinerichrepeat,LRR),丝氨酸苏氨酸蛋白激增产物不一定是某一基因家族成员。③基因家族成酶(serine-threorinekinase,STK),亮氨酸拉链员往往成簇存在,克隆的基因片段是否为目的基因(leucinezipper,LZ),跨膜结构(transmembrane,尚需进一步判断。因此对PCR扩增产物和克隆产TM)等。国内不少学者根据抗性基因的保守序列物,有必要进行基因与性状共分离分析,插入失活或
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遗传转化等功能鉴定工作,以便最终筛选到目的基
5 差异表达基因的分离方法(differ2因。
entiallyexpressedgenecloningmeth2
4 表达序列标签法(expressedse2ods)quencetaggingmethod,EST) 生物体的生长发育衰老过程是遗传信息有序的
1990年以来的人类基因组计划和其它模式生时空表达的结果,因而分离差异表达基因将是认识物的基因组计划在基因序列、定位、表达和功能研究生命活动过程的入手点,只有以此为基础,才能深入
理解基因的结构、功能、表达与调控。而差异表达基
上积累了大量的数据,怎样利用它们更快捷,更经济
因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一
地克隆基因,一直吸引着人们的视线,利用计算机协
化发展为多元化,而且呈各种方法互相结合的趋势。
()助克隆基因siliconcloning逐渐成为克隆基因中不
分离差异表达基因的3种基本方法为:差式筛
可缺少的部分,如同源性比较、计算机辅助结构、功
选(differentialscreening[40])、扣除杂交(subtraction
能分析、引物设计等。EST是完整基因上能够特异hybridization[41,42,43])、差异展示反转录PCR(differ2性标记基因的一部分序列,通常包含了基因足够的entialdisplayreversePCR,DDRT-结构信息区,从而与其它基因相区分,大规模EST
PCR[44])。克隆和EST资料库的建立[34,35],为利用生物信息目标样target,TS)和无特异学克隆基因提供了条件。该方法的基本过程为:①(,RS,以下简称对已知的部分序列进行数据库分析,筛选出代表新cDNA,并构建Ts的基因的EST及相应的重叠群,定位信息等,,TS和RS中提取mRNA制成得信息设计引物,制备探针。②探针,分别用TS和RS的cDNA探针与Ts文库筛选,得cDNA得cDNAPCR和5’、3’-RACE,得5’3(约400bp)。③
cDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交,选出只与TS杂交,而不与RS杂交的克隆即为Ts特异表达
的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交,不仅费力费
钱,重复性差,而且灵敏度很低。扣除杂交则是用
对所得阳性克隆和末端序列进行测序。④通过数据
TS提取的mRNA反转录成cDNA探针与RS的过
库对新序列进行分析,包括与已知基因的同源性分量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去析、拼接延伸、ORF识别、结构分析、翻译蛋白质分杂交分子和过量的RS的mRNA或cDNA,将不形析等。⑤若第一步有新EST的定位信息,即可对基成杂交体的TS的cDNA纯化富集,扩增,建立相应因进行定位和结构分析;若无定位信息,还要筛选基cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库。但此法因组文库,进行测序和FISH定位等工作。⑥最后回收cDNA量有限,重复性差,灵敏度低。DDRT-对发现的新基因进行突变检测和表达分析。
PCR则是分别用TS和RS的总mRNA作模板,利
该方法是建立在大量已有的生物信息资源基础用12个可能的锚定引物T11MN锚定mRNA的上的,同时结合了目前的新技术,为大规模克隆基因polyA末端,借助逆转录酶合成cDNA第一链,得
锚定引物和5’端随机提供了捷径,但前提是手头要有已知的序列。目前,mRNA/cDNA,再用相同的3’
引物分别扩增TS、RS的mRNA/cDNA,扩增产物
国际上相当数量的基因分离是从分析同源EST开
用序列胶电泳分析差异表达情况,将差异带DNA
始的。如田芳等探讨了如何用EST法发现、克隆肿
回收,可进一步鉴定分析,最终获得差异表达基因。[36]
瘤基因,Okano等利用此法克隆到一族新的哺乳
它与前二者相比,速度快,易操作,可以鉴定低丰度
[37]
动物的DNA52胞苷甲基转移酶基因。Dymock
差异表达的mRNA,分析2种以上样品基因的差异
等通过EST数据库分析克隆到细胞分裂素的1个表达等优点,但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增
[38]
跨膜受体基因GCR1。Vasmatzis等通过EST数片段短等问题。DDRT-PCR自提出以来,也在不据库分析发现了3个在前列腺中特异表达的基因,断地加以改进和发展,力求不断完善[45,46]。可以用于前列腺癌的基因治疗[39]。PCR技术的发展和新技术的出现为差异表达
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基因的分离方法注入了新的活力。如在差式筛选中引入PCR[47,48],不仅提高了效率,还降低了假阳性率。1993年Lisitsyn等将PCR引入扣除杂交,发展了扣除扩增方案。同时用特异引物结合法在PCR中主动选择扩增差异cDNA,形成了代表性差示分析法(representationaldifferenceanalysis,RDA)[49\〗。1996年Diatchenko等采用抑制性PCR
NA。然后用限制性内切酶切,将酶切片段装上接
头,末端补平后,加入接头引物进行PCR扩增。
2)扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头,用过量的drivercDNA与之杂交退火,将形成三种产物:tester/tester、tester/driver、driver/driver。
3)特异性片段的扩增。末端补平后,加入新接
选择性扩增差异基因片段,即利用DNA链内退火头引物进行PCR。3种产物中仅自身退火形成的优先于链间退火,使非目的序列在退火时产生发夹tester/tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增,式互补结构,无法与引物配对,从而选择性抑制非目tester/driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增,的基因片段的扩增,由此提出了抑制性差减杂交PCR法(suppressionsubtractionhybridization,SSH)[50]。另外也有人就在主动选择差异基因片段上动脑筋,如采用粘性限制性酶切位点[51],抗生蛋白链菌素包被磁珠分离和酶切保护[52]等方法主动
Driver/driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸
酶去除单链DNA分子,再进行PCR富集特异表达cDNA片段。
4)对特异片段进行克隆,FISH等技术进一步分离特异表达基因。
选择差异片段。Straus等受cDNA扣除杂交的启发,提出了基因组扣除方案[53],若研究的基因存在。Hubank等利用该基因缺失的突变体,就可以用变性的野生型基因V(D)J重组的基因组DNA与缺失基因组DNA进行扣除杂交,G22,并在Pre2B细胞系1~8中分离“多出来的那个片段”。[59]。朱玉富集,组DNA,,因而需经多轮扣除杂交。以上这些方法在具体操作中,也会将其中2种结合使用,如差式筛选和扣除杂交,先通过扣除杂交,找出大部分单链差异基因片段,对这些单链差异基因片段再建cDNA文库,通过对这种文库的差式筛选,找到差异表达基因,不仅减少了工作量,也提高了灵敏度。Kang等利用扣除杂交后的RNA或DNA样品进行DDRT-PCR,发展了交互式差减差异RNA显示(reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay,RSDD)技术[54]。它结合了扣除杂交和DDRT-PCR的优点,成为一种高效、快速分离差异
贤等用cDNARDA法比较GA处理和未经GA处理
的豌豆细胞内基因表达差异,发现该豌豆细胞内有数个被GA特异性抑制的mRNA,并克隆了其中分子量最大的片段PGAS123[60]。湛凤凰等应用cD2NARDA法分离到4个在鼻咽癌中缺失的片段,可能为具抑癌功能的已知基因或新基因[61]。Fu等用此法克隆到一在巨噬细胞中上调表达的新基因
[62]
DLM21。此法具有高效、敏感、阳性率高的特点。但两处理样间若存在较大差异,或某些基因在TS中存在上调表达,效果则不十分理想。5.2 抑制性差减杂交PCR法(SSH)
SSH的基本流程如图4所示。
1)第1次杂交。提取TS和RS的mRNA反转
表达基因的方法。而为了适应于对大量基因进行全
面、系统的差异分析,cDNA微列阵(cDNAmicroar2ray)、DNA芯片(DNAchip)[55,56,57]和综合性基因鉴定(Integratedprocedureforgeneidentification,IPGI)[58]技术也开始建立起来。下面对RDA、SSH、RSDD3种方法作一下详细介绍。5.1 代表性差示分析法(RDA)
RDA的操作过程如图3所示。
1)制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反
录为testercDNA和drivercDNA,用RsaI或HaeⅢ酶切成平头末端cDNA,分成均等2份,分别加不同的接头,再分别与过量的drivercDNA杂交,将形成4种产物:a,单链testercDNA、b,自身退火的tester/tester双链、c,异源退火tester/driver双链、d,drivercDNA。
2)第2次杂交。合并2份杂交产物,加入新的变性drivercDNA退火、杂交,这次除了a、b、c、d4种产物外还形成产物e,e是tester自身退火形成,
转录制备双链cDNA即testercDNA和drivercD2
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图3 RDA[49]4 SSH[50]
Fig.3 RDAFig.4
SSH
图5 RSDD[54])
Fig.5 RSDD
但两端带不同接头。合呈线性扩增,仅e两端可配不同引物而呈指数扩
3)特异性片段的扩增。末端补平后,先后加接增。头的内、外侧引物扩增,a和d无扩增,b由于两端接4)特异性片段e克隆,并进一步分离差异表达头互补形成发夹结构也无扩增,c仅一端有引物结基因。
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该法通过2次杂交和2次PCR,使假阳性率可每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制降到6%[63],且灵敏度高。用SSH可一次同时分离因素,因而我们必须根据所克隆基因的类型和实际几十至几百个差异基因,使效率大增。但由于SSH条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累,克隆需mRNA量大(几微克),对mRNA来源困难的材基因的技术也逐步完善,速度效率也不断提高,相信料不利。因为SSH对不同材料或材料间存在小片人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术。段缺失不能有效检测,所以研究材料的差异不能太大。SSH主要集中在肿瘤基因的克隆上,也有用于细胞凋亡研究的[50]。Zhang等用SSH法克隆到人视网膜簇状蛋白的1个新基因———CLULI基因[64]。
5.3 交互差减差异RNA显示(RSDD)
RSDD的主要过程如图5所示。
1)交互差减。分别提取具有差异表达的2种组
(1):57~60
2 解 涛,梁卫平,丁达夫.后基因组时代的基因组功能注释.生物
参 考 文 献
1 李子银,陈受宜.植物的功能—基因组学研究进展.遗传,2000,22
化学与生物物理进展,2000,27(2):166~170
3 LusserA,BroschG,LoidlA,etal.Identificationofmaizehistone
deacetylaseHD2asaacidicnuclearphosphoprotein.Science,1997,277:88~91
4 CarsteaED,MorrisJA,Colemanal.Niemann2picktype
C(NP2C)gene:cholesterolhome2,:5ECJ,EM.Cloningofthe
IMgeneidentifiesarolefarnesylationinmeris2ProcNatlAcadSciUSA,2000,97(13):7633
织细胞A、B的mRNA,反转录为cDNA,并构建cD2NA文库。将这2个文库进行交互差减得到A减B
和B减A的2个差减cDNA文库,由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构,载体进入宿主后,其上质粒载体被切下,得质粒cDNA文库2)差异显示。用3’2锚定引物和52对2个差减文库提取的DNA,将扩增产物用5%带,回收差异获得富集的差异表达片段。
3)表达分析。采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的
~7638
6 YangZN,MirkowTE.Isolationoflargeterminalsequencesof
BACinsertsbasedondouble2restrictionenzymedigestionfollowedbyanchoredPCR.Genome,2000,43:412~415
7 GiraudatJ,HaugeBM,ValonC,etal.IsolationoftheArabidop2
sisABI3genebypositionalcloning.Plantcell,1992,4:1251~
1261
8 ArondelV,LemieuxB,HwangI,etal.Map2basedcloningofa
genecontrollingomega23fattyaciddesaturationinArabidopsis.Sci2ence,1992,258:1353~1355
9 MartinGB,BrommonschenkelSH,ChumwongseJ,etal.Map2
basedcloningofaproteinkinasegeneconferringdiseaseresistanceintomato.Science,1993,262:1432~1436
10 SongWY,WangGL,ChenLL,etal.Areceptorkinase2like
proteinencodedbythericediseaseresistancegeneXa21.Science,1995,270:1804~1806
11 LagudahES,MoulletO,ApplesR.Map2basedcloningofagene
sequenceencodinganucleotidebindingdomainandaleucine2richre2gionattheCre3nematoderesistancelocusofwheat.Genome,1997,40(5):659~665
12 SarmaRN,FishL,GillBS,etal.Physicalcharacterizationof
thehomologousgroupschromosomesofwheatintermsofricelink2ageblocks,andphysicalmappingofsomeimportantgenes.Genome,2000,43:191~198
13 ScharfJM,EndrizziMG,WetterA,etal.Identificationofa
candidatemodifyinggeneforspinalmuscularatrophybycomparativegenomics.NatureGenetics,1998,20:83~86
14 FeldmanKA,MarksMD.Agrobacterium2mediatedtransforma2
真伪。反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜,分别与来自A、B细胞系的总mRNA经反转录制备的32P标记的cDNA第一条链
探针进行杂交,只与亲本来源细胞系杂交,而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。
4)对差异片段克隆、测序,并进一步分离获得差异表达的基因。
RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化
而在基因组中差异表达的基因,它结合了DDRT-PCR和扣除杂交的优点,减少或消除了共有序列,
使序列胶上条带清晰度增加,并使低丰度序列得到富集,降低了假阳性率,且RSDD仅用较少的引物进行逆转录PCR就可分析全部差异表达基因,但RSSD并不能完全杜绝假阳性。Kang等用RSDD
法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene)和抑制肿瘤发展的基因(PSGene)[54]。
基因克隆的技术发展很快,种类也越来越多,但
第6期周国岭等:基因克隆技术
hormoneencodingcDNA.Gene,1991,103:243~247
591
tionofgerminatingseedsofArabidopsisthaliana:anon2tissuecul2tureapproach.Molecular&GeneralGenetics,1987,208:1~915 JohalGS,BridgsSP.ReductaseactivityencodedbytheHM1
diseaseresistancegeneinmaize.Science,1992,258:985~98716 JonesDA,ThomasCM,Hammond2KosackKE.Isolationofthe
tomatoCf29forresistancetoCladosporiumfulvumbytransposontagging.Science,1994,266:789~793
17 AartsMGM,DirkseWG,StiekemaWJ.Tranposontaggingof
amalesterilitygeneinArabidopsis.Nature,1993,363:715~71718 CuiXQ,WiseR,SchnablePS.Therf2nuclearrestoregeneof
male2sterileT2cytoplasmmaize.Science,1996,272:1334~133619 YanofskyMF,MaH,BowmanJL,etal.Theproteinencoded
bytheArabidopsishomeoticagamousresemblestranscriptionfac2tors.Nature,1990,346:35~39
20 PuzioPS,LausenJ,etal.IsolationofagenefromArabidopsis
thalianarelatedtonematodefeedingstructure.Gene,1999,239:
33 AlmulyR,CavariB,FersthmanH,etal.Genomicstructureand
sequenceoftheglitheadseabream(Sparusaurata)growthhormoneencodinggene:identificationofminisatellitepolymorphisminintronI.Genome,2000,43:836~845
34 RousleySD,GlodekA,SuttonG,etal.Theconstructionof
Arabidopsisexpressedsequencetagassembles:anewresourceto
facillitategeneidentification.PlantPhysiol.,1996,112:1177~1183
35 AdamsMD,KelleyJM,GocayneJD,etal.Complementary
DNAsequencing:expressedsequencetagsandHumanGenomePro2ject.Science,1991,252:1651~1656
36 田 芳,陈主初.运用生物信息方法快速获取与肿瘤基因同源的
EST及其新基因克隆的策略.生命科学.2000,12(2):72~7537 OkanoM,XieSP,LiE.Cloningandcharacterizationofafamily
ofnovelmammalianDNA(cytosine25)methyltransferases.NatureGenetics,1998,19(3):219~220
38 DymockPS,DymockD,plantseven2trans2
membranecytokinins.Current,(16):~G,U,etal.Discoveryofthree
expressedinhumanprostatebyexpressedsequenceanalysis.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(8):300
163~172
21 KumarCS,NarayananKK.Planttransposableelementandfunc2tionalgenomics.PlantBiotechnology,1998,15(4):159~16522 ZwaalRR,BroeksA,MeursJ,etal.Target2selectedgeneinacti2vationinCaenorhabditiselegansbyusingafrozentransposoninser2tionmutantbank.ProcNatlAcadSciUSA,1993,90:7435
23 KrysanPJ,YoungJC,TaxF,etofDNAinsertionwithinAtransduc2tionandionSci.U.S.A,1996,93:8145~8150
24 MckinneyEC,Ali,TrautA,etal.Sequence2basedidentifilca2tionofT2DNAinsertionmutationsinArabidopsis:actinmutantsact221andact421.PlantJournal,1995,8:613~622
25 KoesR,SouerE,HouwelingenA,etal.Targetedgeneinactiva2tioninpetuniabyPCR2basedselectionoftransposoninsertionmu2tants.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92:8149~8153
26 WinklerRG,FrankMR,GalbraithDW,etal.Systematicre2versegeneticsoftransfer2DNA2taggedlinesofArabidopsisisolationofmutationsinthecytochromeP450genesuperfamily.PlantPhysi2ol,1998,118:743~750
27 王石平,刘克德,王江等.用同源序列的染色体定位寻找水稻抗
~304
40 HuynhTV,YoungRA,DavisRW.Constructingandscreening
cDNAlibrariesinλgt11inGloverDMed.DNAcloning:apracticalapproach.Oxford:IRL,1988
41 HedrickSM,CohenDI,NielsenEA,etal.IsolationofcDNA
clonesencodingTcell2specificmenbrane2associatedproteins.Na2ture,1984,308:149~153
42 DuguidJR,RohwerRG,SeedB.IsolationofcDNAsofscrapie2
modulatedRNAsbysubtractivehybridizationofacDNAlibrary.ProcNatlAcadSciUSA,1988,85:5738~5742
43 SiveHL,JohnTS.Asimplesubtractivehybridizationtechnique
employingphotoactivablebiotinandphenolextraction.NucleicAcidsRes,1988,16(22):10937~10938
44 LiangP,ParadeeAB.Differentialdisplayofeukaryoticmessenger
RNAbymeansofthepolymerasechainreaction.Science,1992,257:967~971
45 SokolovBP,ProckopDJ.ArapidandsimplePCR2basedmethod
forisolationofcDNAfromdifferentiallyespressedgenes.NucleicAcidsRes,1994,22(19):4009~4015
46 荀德明,李文鑫,蒋达和等.用改进的DDRT2PCR技术进行人
病基因DNA片段.植物学报,1998,40(1):42~50
28 李子银,陈受宜.水稻抗病基因同源序列的克隆、定位及表达.科
学通报,1999,44(7):727-733
29 薛勇彪,唐定中,张燕生等.水稻基因组中R类抗病基因同源序
列的分离.科学通报,1998,43(3):277~281
30 PavesiA,FicarelliA,TassiF,etal.Cloningoftwoglutamatedehy2drogenasecDNAsfromAsparagusofficinalis:sequenceanalysisandevo2lutionaryimplication.Genome,2000,43:306~316
31 GaoM,ChibbarRN.Isolation,characterizationandexpression
analysisofstarchsynthaseIIacDNAfromwheat(Triticumaes2
tivumL.).Genome,2000,43:768~775
胚差异基因筛选.生物化学与生物物理进展,2000,27(2):
205~209
47 DuguidDJ,DinauerMC.LibrarysubtractionofinvitrocDNA
librariestoidentitydifferentiallyexpressedgenesinscrapieinfection.NucleicAcidsRes,1990,18(9):2789~2792
48 SangJ,ThompsonNJ.Anefficientprocedureforobtaininglong
cDNAclonesfromphagelibraryscreening.Biotechnique,1994,17:447~451
32 FunkensteinB,ChenTT,PowersDA,etal.Molecularcloning
andsequencingoftheglitheadseabream(Sparusaurata)growth
592 华中农业大学学报第20卷
49 LisitsynN,LisitsynN,WiglerM.Cloningthedifferencebetween
twocomplexgenomes.Science,1993,259:946~951
50 DiatchenkoL,ChrisLauYF,CampbellAP,etal.Suppression
subtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyreg2ulatedortissue2specificcDNAprobes.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(12):6025~6030
51 ZengJ,GorskiRA,HamerD.DifferentialcDNAcloningbyen2zymaticdegradingsubtraction(EDS).NucleicAcidsRes,1994,22(21):4381~4385
52 LaveryDJ,MolinaLL,OlelaFF,etal.Selectiveamplification
viabiotin2andrestriction2mediatedenrichment(SABRE),anovelselectiveamplificationprocedurefordetectionofdifferentiallyex2pressedmRNAs.ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(13):6831~6836
53 StrausD,AusubelFM.GenomicsubtractionforcloningDNAcor2respondingtodeletionmutations.ProcNatlAcadSciUSA,1990,87:1889~1893
54 KangDC,FranceRL,SuZZ,etal.Reciprocalsubtractiondif2ferentialRNAdisplay:anefficientrapidprocedureforisolationdif2ferentiallyexpressedgenesequences.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(23):13788~13793
55 ScheaM.QuantitativemonitoringofgeneexpressionpatternscomplementaryDNAmicroarray.Science,,:46756 DeRisiJ.UseofcDNAmicroarrayternsinhumancancer.NatureGenetics,1996,14:457~46057 ScheaM.Parallelhumangenomeanalysis:microarray2basedex2pressionmonitoringof1000genes.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:106140~106149
58 WangSM,RowleyJD.Astrategyforgenome2widegeneanaly2sis:integratedprocedureforgeneidentification.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(20):11909~11914
59 HubankM,SchatzDG.IdentifyingdifferencesinmRNAexpres2sionbyrepresentationaldifferenceanalysisofcDNA.NucleicAcidsRes,1994,22(25),5640~5648
60 湛凤凰,江宁,曹利等.应用代表性差异分析法筛选人癌候选抑
癌基因.生物化学与生物物理进展,1999,26(2):165~169
61 朱玉贤,张翼凤,李惠英.用cDNA差式分析法克隆受GA抑制
的豌豆基因.中国科学,1997,27(3):253~357
62 FuY,ComellaN.CloningofDLM21,anovelgenethatisup2reg2ulatedinactivatedmacrophages,usingdifferentialdisplay.Gene,1999,240:157~163
63 SteinOD,W,screening
genes.NucleicAcidsRes,25):,AclandGM,etal.Molecularcloning,charac2andexpressionofanovelretinalclusterin2likeproteincD2NA.Gene,2000,243:151~160
GeneCloningTechniques
ZhouGuoling YangGuangsheng FuTingdong
(HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070)
Abstract Therationale,applicationandapplicationpotentialandsomefactorsoflimitationofsomeim2portantgenecloningtechniqueswerestudiedinthispaper.Thegenecloningtechniguesincludemap2basedcloningorpositionalcloning,transposonorT2DNAtaggingmethod,homology2basedcandidategenemethod,expressedsequencetaggingmethodandsomedifferentiallyexpressedgenecloningmethodinthisstudy.
Keywords genecloning,map2basedcloning,transposontagging,T2DNAtagging,homologoussequence,expressedsequencetagging,differentiallyexpressedgene
(责任编辑:杨锦莲)