第一链cDNA合成试剂盒
First-Strand cDNA Synthesis Kit
（反转录试剂盒）
一、试剂盒组成： Material Provided
2X First-Strand Buffer
RT-mix
Random primer (0.1μg/μl)
Oligo(dT)18 primer (0.1μg/μl)
DEPC-treated Water
Protocol
注意：所有试剂必须在-20℃保存。
ZK402 (50次) 500 μl 50 μl 50 μl 50 μl 1ml 1份
二、简介：
本试剂盒提供的试剂能从微量的poly(A)+ mRNA或总RNA中高效率的合成出cDNA第一链。MMLV Reverse Transcriptase是已知反转录酶中RNA反转录活性最强的一种。它能非常有效地以RNA为模板，在Oligo(dT) primer, Random Primers或其它特定的引物与RNA 退火后，从引物的3’-末端合成与RNA互补的DNA（cDNA第一链）。第一链cDNA可以用于后续的荧光定量PCR(与荧光定量PCR核心试剂盒配合使用)、RT-PCR、cDNA库构建等实验。
三、准备工作：
1）用0.1%DEPC水过夜室温或37C处理1.5 ml Eppendorf 管和取液用10μl, 200μl和1 ml Tip, 高温蒸气灭菌，80℃烘干备用。
2）制备RNA模板。总RNA和mRNA均可以作为First-Strand cDNA合成的模板材料。本试剂盒每次反应需要500ng-2μg左右 总RNA或者25-50ng左右的mRNA。RNA溶于DEPC－H2O，体积小于8μl。
四、First-Strand cDNA合成：
注意：戴手套进行以下操作，严防RNase污染。
１．在1.5ml Eppendorf管中加入500ng-2μg 总RNA, 或25-50ng poly(A)+ mRNA。加入DEPC－H2O使总体积为8μl。
２．加入1μl Random primers，或1μl Oligo(dT)18 primer，或者1ul的特异性下游引物(25pmol/ul)。小心混匀。
３．65℃保温５分钟。
４．室温放置10分钟。室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。 ５．按次序分别加入下列试剂：
2X First-Strand Buffer 10ul
RT-mix 1ul
Total: 20ul
６．小心混匀，如果是用Random primers ，建议25℃10分钟，40℃50分钟；如果是用
Oligo(dT)18 primer，建议42℃50分钟；如果是用特异性的下游引物，建议48℃50分钟。
７．然后90℃处理５分钟。冰上冷却，室温高速离心5秒钟，将所有溶液收集到管底。 ８．反转录好的cDNA可以用于PCR扩增、荧光定量PCR检测或cDNA的2nd链的合成。
五、注意：