中药中有机酸的提取分离与测定
摘要：综述了中药中有机酸类成分的提取分离及测定方法研究进展。 随着天然产物的化学和药理学研究不断深入及分析手段突飞猛进的发展,中药有机酸类成分的研究引起了国内外许多学者极大的兴趣。我国天然有机酸资源丰富,在中药中已经发现了较多种类和数量的有机酸类成分,越来越多的研究证明,中药中的有机酸类成分具有广泛的生物活性[1]。传统的和现代的提取分离和测定方法各有优劣，采用合适的提取分离和测定方法，不仅可以提高提取及检测效率，还可以为后续有机酸的提取分离及测定带来方便。
关键词:有机酸;提取分离;测定
1 中药有机酸类成分的提取分离
中药中有机酸提取分离方法的选择主要是根据其结构性质的不同来确定最佳方法。
1.1 碱提酸沉法
有机酸在植物中成盐或者呈游离态时,可用水或者稀碱水(如1%碳酸氢钠)直接提取,提取液酸化后滤出沉淀,提取液加无机酸酸化后,析出总游离有机酸,以过滤法或非极性有机溶剂萃取法得总有机酸。陈琦等[2]通过比较别采用超声提取法、碱提酸沉法、酸沉后有机溶剂萃取法、有机溶剂加酸水直接提取法等多种方法提取鹅不食草总有机酸，并用分光光度法测定总有机酸含量。结果发现碱提酸沉法为鹅不食草总有机酸最佳提取方法，总有机酸含量为67.3%。
1.2 有机溶剂提取法
溶剂提取法一般指从中草药中提取有效部位的方法，根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性，选用对活性成分溶解度大、对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。由于游离的有机酸(分子量小的除外)易溶于有机溶剂而难溶于水,有机酸盐则易溶于水而难溶于有机溶剂,所以一般可先酸化使有机酸游离,然后选用合适的有机溶剂提取。张毅等[3]利用正交试验优选宣木瓜总有机酸，采用不同乙醇浓度对宣木瓜进行提取，最佳提取工艺为乙醇浓度80%，料液比为1:25，提取温度为90℃，提取时间为3h，宣木瓜总有机酸的得率为10.46%，表明该工艺稳定、可行，适用于工业化生产。鲁旺旺等[4]考察低温酶解辅助乙醇浸提法代替传统乙醇回流法提取青梅中有机酸的得率，研究结果表明果胶酶对青梅酶解能力显著，影响青梅有机酸提取效果的主要因素为酶解温度、酶解时间、酶添加量。青梅中有机酸适宜酶解辅助浸提提取的工艺条件为酶添加量31.6U/mL、酶解温度45.67℃、酶解时间3.41ｈ，相应提取液中总有机酸的提取率为35.49％，较传统乙醇回流法提取率（29.10％）有显著提高。
1.3 超临界提取法
一种流体（气体或液体），当温度和压力均超过相应临界点值时，则称该状态下的流体为超临界流体。超临界流体萃取技术（SFE）是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对重要有效成分进行提取分离的新型分离技术，在超临界状态下，流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和分子质量大小的不同成分萃
取出来[5-6]。蒋盛岩等[7]采用超临界二氧化碳流体萃取技术，提取夏枯草果穗中的熊果酸，并用高效液相色谱法测定萃取物中熊果酸含
量．在萃取温度为30℃，萃取压力为15MPa，携带剂甲醇:乙醇=1:1，萃取时间为90min时萃取效果好，萃取物中熊果酸含量高，熊果酸提取比较完全．
1.4 超声提取法
超声提取技术(UAE)是利用超声波的强振动、高加速度、强空化效应、强搅拌作用来缩短天然产物有效成分进入溶剂的时间,加快提取过程,提高提出率,并有效避免高温对有效成分的破坏[8]。潘明等[9]采用超声波强化提取荠菜中有机酸，在温度70℃,时间35min,料液比1:18(g/mL),超声波功率140W组合参数条件下,有机酸提取率1.76%。
1.5 微波提取法
微波提取(萃取)即微波辅助提取(MAE)，是利用微波场的特性和优点来强化天然药物(中药)有效物质浸出的新型提取方法。微波提取方法适用于对热稳定的有效成分，但对于热敏性物质，微波加热能导致其变性失活，富含淀粉、树胶的天然植物也不适合[10]。在比较煎煮法、加热回流法及微波法提取升麻中阿魏酸时，赵志添等[11]对其提取工艺进行比较,确定微波法为最佳提取方法。在乙醇体积分数70%、液料比20:1(mL/g)、微波辐射时间90s、微波辐射功率385W,在此条件下,阿魏酸提取率可达0.0593%。
1.6 水蒸汽蒸馏法
某些挥发性的低级脂肪酸或者芳香酸还可以用水蒸气蒸馏法分
得,操作简单方便,但使用范围有限。
2 中药有机酸类成分的测定
2.1 中药总有机酸的含量测定
《中国药典》2010年版一部附录ⅧA中采用电位滴定法测定总有机酸的含量。中药提取液的颜色往往比较深,从而干扰了摘定终点的确定,限制了它的应用。这种情况下可采用电位滴定法,即利用电位的变化来确定滴定终点,此法用于中药中总有机酸含量的测定更为准确。李永慧等[12]采用用85%乙醇回流提取五味子中有机酸，避免了 酸碱滴定法中有机酸提取液颜色较深对滴定终点的干扰。朱晨晨等[13]以水为溶剂，通过试验，采用电位滴定法考察不同加工方法和不同贮藏时间对木瓜药材中水溶性有机酸含量的影响。研究表明，木瓜水溶性总有机酸的滴定曲线呈现出明显的滴定突跃和较大的突跃范围，与苹果酸对照品的滴定曲线极其相似。
直接电位滴定法可以定量测定但没有消除其他具有羧基的物质如氨基酸类的干扰，对于一些同时含有氨基酸和有机酸的药材及其制 剂来说会使测定结果出现偏差。刘丽敏等[14]建立板蓝根药材及颗粒中总有机酸含量测定方法，将板蓝根药材、颗粒以70%乙醇回流提取或分次溶解后，通过SA-2阳离子树脂消除氨基酸干扰后采用直接电位滴定法测定总有机酸的含量。张奇等[15]五味子提取物用水溶解,经001×1阳离子交换树脂将盐还原为酸，以琥珀酸为对照品,用电位滴定法测定五味子提取物中总有机酸的含量稳定性、重复性良好。
为有效避免直接滴定法中因有机酸成分强弱不一而导致滴定反
应速度缓慢的特点可采用反滴定法[16]。以水杨酸为对照品，潘利明等
[17]应用电位返滴定法测定了广东省10个不同产地及广州地区不同月份采集的玉叶金花药材，方法的重复性、精密度及稳定性都比较好,可操作性强。
2.2 中药有机酸类单体成分的分析测定方法
2.2.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法(HPLC)是目前应用最广泛的液相色谱法,其分离模式与检测方法多种多样,可以根据样品的构成与性质来选择合适的色谱条件(色谱柱、流动相、检测器)。有机酸在水中很容易发生电离,产生多峰现象。为了使有机酸尽可能地以分子形式存在,一般使用酸 性流动相来抑制有机酸的离解。通常在流动相中加入磷酸盐缓冲液、冰醋酸、磷酸等。
査孝柱等[18]使用Shim-pack CLC-ODS色谱柱，流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(265:35:0.1:0.05)，二极管阵列检测器，检测波长为210nm,对含齐墩果酸和熊果酸的10种果实类中药HPLC分析，所建立的色谱条件下，齐墩果酸与熊果酸之间分离度均较好(R>1.68)。陶君彦等[19]Kromasil C18色谱柱流动相:(A)乙腈、(B)0.05%磷酸进行梯度洗脱,检测波长325nm,测定了木瓜中绿原酸、咖啡酸的含量，所得结果重现性好,能很好控制木瓜的药材质量。
2.2.2 高效毛细管电泳法
高效毛细管电泳法(HPCE)为近年来发展最快的一种分离分析技术,具有分离效率高、分析速度快和样品用量少等优点。HPCE是以高
压电场为驱动力,以毛细管为通道,依据样品中各组分之间电泳或分配行为的差异而实现分离的液相分离技术[16]。
赵陆华等[20]建立了乌骨藤药材及其制剂中绿原酸的毛细管电泳分离分析方法,分析测定了其中绿原酸的含量,色谱条件:缓冲液
200mmmol/L硼酸和10%甲醇(调节PH=8.0),分离电压30kV,检测波长328nm,温度25℃。测定结果准确、重复性好,可为乌骨藤药材及其制剂的质量研究提供一种新的分析方法。迟道兵等[21]将紫外分光光度计与高效毛细管电泳两种测定熊果酸的方法进行比较分析，发现高效毛细管电泳法简便、快速, 准确度和灵敏度均明显高于紫外分光光度法, 并建立了高效毛细管电泳(HPCE)法测定山茱萸中熊果酸含量的方法。该方法建立的条件为以15mmol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)-15 mmol/L硼砂(Na2B4O7)(pH9.22)、含10%甲醇(v/v)的缓冲体系作为运行电解质溶液, 检测波长214 nm分离电压20.0kV, 可实现熊果酸分离检测。
2.2.3 液质联用法
中药材及中成药中有机酸含量的测定多采用HPLC-UV法或
HPLC-ELSD,但这两种方法受外界条件影响大,试验结果重现性和灵敏度等不够理想。有报道称采用高效液相色谱三重四级杆液质联用(HPLC-MS/MS)法,所得结果灵敏度高、选择性好和稳定性均能满足要求,能够更准确快速地分析样品中有机酸的含量[22]。
严志宏等[22]采用液质联用(LC-MS/MS)法测定金樱子中熊果酸和齐墩果酸的含量,色谱柱DiamonsilC18,流动相甲醇-甲酸水(87:13),质谱
采用大气压电喷雾离子源,选择性离子流模式(负离子)。所得结果表明该方法快速简便,灵敏度高,重现性好，可用于金樱子的质量控制。朱根华等[23]采用三重四级杆液质联用法测定金樱子中白桦脂酸，色谱柱Diamonsil C18流动相甲醇-0.2%的甲酸溶液(84:16)。
2.2.4 气质联用法
气质联用法(GC-MS)技术在中药有机酸类成分的测定分析在中药有机酸类成分的测定中,主要用于长链脂肪酸的分析和测定。在酚酸和小分子脂肪酸方面的应用较少。
脂肪甲酯化是气相色谱测定脂肪酸的关键步骤,常用的如重氮甲烷法、三氟化硼催化法、硫酸盐酸催化法及快速甲酯化法等[24-25]。金高娃等[26]用气相色谱-质谱联用仪并改良脂肪酸甲酯化法检测出山楂果肉中的7种脂肪酸,分别为棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸、花生酸及山嵛酸。
2.2.5 薄层扫描法
薄层扫描法(TLC)系指用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。从最近研究来看,TLC用于中药中萜酸的研究较多。郑文媛等[27]采用薄层扫描法对山楂中的熊果酸进行含量测定，实验表明其甲酸的加入量为0. 5ml时,熊果酸的斑点无拖尾现象且较集中,斑点无干扰等优点。实验以优化的环己烷-醋酸乙酯-甲酸(20:8:0.5)为展开条件对熊果酸进行测定，结果重现性好,便于快速、准确测定。康连香采用薄层扫描法[28],
点样于硅胶G板上,展开剂为苯-乙酸乙酯-乙酸(2:0.8:0.3),上行展开,反射法锯齿扫描,采用外标两点法计算琥珀酸含量。半夏药材中琥珀酸含量以山西产区最高,为0.0254%;其次为安徽产区,含量为0.0211%;最低为湖南产半夏,含量为0.0038%。
3.小结
有机酸作为中草药的重要活性成分之一,受到越来越多的国内外学者的关注,前景广阔。本文仅针对中药有机酸类成分在实践中应用最广泛的几种提起分离及测定方法做一综述,随着分析手段的不断发展,肯定会不断涌现出更多方便、快捷、有效的分离提取及测定方法,但每种方法各有其适用范围。在具体应用中,还应考虑到药物中其他成分的干扰等因素,综合分析,选用一种方法或者多种方法相结合,以达到最佳效果。
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