枇杷DXR基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析

　　摘 要：【目的】为了解枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）还原异构酶基因（DXR）的序列特点及其在果实成熟过程的表达特性，【方法】以不同类型枇杷品种‘早钟6号’ （红肉） 和‘白玉’（白肉）不同成熟阶段的果肉和果皮为试材，采用RT-PCR 结合RACE 法和qRT-PCR方法对DXR基因进行了克隆，并对其在枇杷果实成熟过程中的表达进行了分析，【结果】枇杷DXR基因的cDNA序列全长1 743 bp，编码473个氨基酸，蛋白质相对分子质量（Mw）为51 299.8 Da，等电点（pI）为6.52（GenBank 登录号：JX089590）。qRT-PCR分析表明，在枇杷果实成熟过程中，DXR在不同类型枇杷的不同时期表达不尽相同：在果皮中，‘早钟6号’品种的DXR基因在果实成熟的各个阶段的表现为表达量较为稳定，而在‘白玉’品种中，DXR基因的表达存在较为明显的先增加后降低的过程，其表达量在褪绿期达到最高。而在果肉中，无论是‘早钟6号’还是‘白玉’品种，DXR基因的表达从果实成熟过程中的未转色期到黄熟期表现为持续下降；到成熟期时，‘早钟6号’品种的DXR基因存在明显的上调现象，而在‘白玉’品种中则无此明显变化，【结论】DXR基因对于枇杷类胡萝卜素的合成没有限制作用，至少作用不明显。 　　关键词： 枇杷； 果实； DXR； 基因克隆； 实时荧光定量PCR 　　中图分类号：S667.3 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0563-04 　　在植物体内，异戊基焦磷酸（IPP）是类胡萝卜素合成途径中第一个较为直接的前体物质，而类胡萝卜素的生物合成所需的IPP绝大多数都来自质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径[1]。1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）基因能催化1-脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）先异构后还原转化成 MEP；DXP除了用于合成萜类物质之外，还可以用于非萜类物质维生素B1和维生素B6的合成，但DXP一旦经DXR转化形成的MEP只能再转化成萜类物质，因此，DXR活性的高低决定了DXP用于萜类物质合成的比例，从而对类胡萝卜素的合成起到十分重要的作用。DXR基因首先在拟南芥中报道[2]，随后Carretero-Paulet等[3]研究指出：DXR基因由单基因编码，可在多种组织中广泛表达。近年来，在长春花[4]、玉米[5]、金鱼草[6]、银杏[7]、橡胶[8]等多种植物中先后克隆出了该基因。 　　枇杷果实的主要色素是类胡萝卜素，其含量与组成赋予果实不同的颜色。我们通过对枇杷的DXR基因的克隆、序列分析，并结合实时荧光定量PCR 技术对不同类型枇杷果实成熟过程中果肉和果皮DXR表达量进行检测，初步明确DXR的表达规律，从而为研究枇杷类胡萝卜素的积累与DXR基因的表达之间的关系提供依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.2 方法 　　1.2.1 枇杷总RNA的提取及DXR基因cDNA全长的获得 枇杷总RNA的提取参照张玲等[9]的方法。以‘早钟6号’总RNA反转录产物为模板，进行PCR扩增。其中DXR基因保守片段的扩增引物参考金蓉[10]设计的引物。在获得DXR基因的保守片段之后，分别采用3' RACE方法扩增3' 末端序列，5' RACE采用同聚物加尾的方法进行。用天根公司的DNA回收纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化，并与pMD19-T载体（TaKaRa）连接，转化E. coli DH5α，进行蓝白斑筛选。所有测序均由上海美吉生物有限公司完成。将所得保守片段、3' 和5' 片段序列进行拼接，重新设计特异引物，以‘早钟6号’总RNA反转录产物为模板扩增DXR基因cDNA全长。表1示DXR基因克隆所用引物。 　　1.2.2 基因生物信息学分析 利用生物信息学软件BLAST比对分析，找出起始密码子、完整的开放阅读框、终止密码子、5' 非编码区、3' 非编码区和poly（A）尾巴；并通过DNAMAN软件，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，预测分析蛋白质基本理化性质，同时进行多重序列比对。 　　2 结果与分析 　　2.1 枇杷DXR基因的克隆和分析 　　将枇杷DXR基因全长及其推导蛋白质与GenBank 中的序列进行同源性比较，发现在氨基酸水平上，与玫瑰（AEZ53171.1）、毛果杨（XP_002318048.1）、 橡胶树（ABD92702.1）、蓖麻（XP_002511399.1）、葡萄（XP_002282761.1）、番茄（NP_001234553.1）、烟草（ABH08964.1）、金鱼草（AAW28998.1）、拟南芥（XP_002866510.1）等植物的氨基酸序列同源性都大于83%。其中与玫瑰（AEZ53171.1）DXR 同源性最高，为92%。 　　2.2 DXR基因在枇杷果实不同阶段的转录水平分析 　　3 讨 论 　　在转DXR 基因的拟南芥植株中，下调该基因表达引起了花斑、色素沉积减少和叶绿体发育缺陷；而上调基因表达则引起叶绿素、类胡萝卜素增加，还增加了非转基因植株所没有的紫杉二烯[11]。但不是所有植物 DXR 基因都与植物萜类物质合成有密切关系。在番茄果实成熟期间有的类胡萝卜素大量积累过程中，相关的DXR基因的 mRNA水平并没有显著变化，这说明番茄体内 DXR 基因对类胡萝卜素合成没有限制作用[12]。 　　本研究发现：在果皮中，‘早钟6号’的DXR基因在果实成熟的各个阶段的表达量无明显的增加或降低现象，具体表现为表达量较为稳定，而在‘白玉’中，DXR基因的表达存在较为明显的先增加后降低的过程，特别是转色期和褪绿期，其表达量均明显高于‘早钟6号’品种，但到了果实成熟期，‘早钟6号’和‘白玉’果皮类胡萝卜素含量却无明显差异。而在果肉中，特别是在果实成熟期，与‘白玉’相比，‘早钟6号’ DXR基因有一个明显上调的现象，其相对表达量约为‘白玉’的2倍左右，但不足以解释在果实成熟期‘早钟6号’和‘白玉’果肉类胡萝卜素含量相差达10倍之多。由此我们可以推论：DXR基因的对于枇杷类胡萝卜素的合成没有限制作用，至少作用不明显。Fu等[13]研究了不同类型枇杷‘洛阳青’和‘白沙’果实发育过程中的质体变化及质体脂结合蛋白基因（PAP）的表达情况，指出‘白沙’枇杷果肉中不能形成正常的有色体是其类胡萝卜素含量低的原因，PAP可能在枇杷果实有色体形成和转换中起重要作用。‘早钟6号’和‘白玉’不同品种以及果皮和果肉类胡萝卜素的积累差异是否也与此有关，需要进一步验证。（本文图版见插4） 　　参考文献 References： 　　[1] RODR？魱GUEZ-CONCEPCI？譫N M， BORONAT A. 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