利多卡因半数致死量的测定
时间： 08-11-21 授课教师：叶和杨
目的：了解用小鼠测定药物的半数致死量的实验方法，掌握一些药理学实验基本技能，学会一种计算LD 50的简单方法。
原理：
一、简单复习质反应、量反应、LD50、ED50、治疗指数的概念及意义：
量反应：指效应可用连续数量值表示的反应，如血压、脉搏等。
质反应：指效应用是通过计数（即数阳性反应的个数）而取得的，通常以百分率（％）来表示，如死亡。
LD50在质反应是指药物引起半数实验动物死亡的剂量，是衡量药物的急性毒性大小的重要指标。
ED50在质反应则是指引起半数实验动物产生阳性效应的剂量，是衡量药物效应力强弱的重要指标。
药物的治疗指数：LD50与ED50的比值称为药物的治疗指数（therapeutic index,TI）。通常以此值表示药物安全性大小，但其又不能完全表示出药物安全性的差别。因此，安全性还应参考1％致死量（LD1）与95％有效量（ED95）之比值。
二、介绍半数致死量：是指引起实验动物总体的半数死亡的药物剂量，是以动物死亡或存活作为质反应指标的。通常以mg/kg表示。半数致死量的测定是检定药物毒性的一种常用方法，在药理学和毒理学的研究中应用十分广泛。
半数致死量的计算方法很多，本实验只介绍寇氏法。
药物致死量（Lethal Dose 简称LD ）有三种表示方法：最小致死量（MLD ），半数致死量（LD 50）和全致死量（LD 100）。一般来说，一个药物的剂量与反应率之间有着一定的关系。 若以对数剂量作横坐标，发生反应的百分比为纵坐标作图，就可以得到一个以50%反应率处的点为对称的S 形曲线。这是因为在一大群生物对象中，特别敏感或特别不敏感的总是占少数，而大多数的敏感情况总是比较
接近的，形象地说它符合“两头小，中间大”的规律。
由这种曲线可以看出，曲线两端比较平坦，灵敏度差，
剂量不易确定，也就是说，MLD 和LD 100的误差是比较大的，而只有在LD 50处曲线的斜率最大，灵敏度最高，当剂量稍有变动时，反映率就发生明显的变化。因此，常用测定LD 50来衡量药物的毒性。LD 50数值越小，毒性越大。
实验器材：鼠笼，天平，砝码，1ml 注射器，利多卡因（药物浓度1%、1.18%、1.14%、
1.68%、2%；苦味酸，计算器。
实验方法：
第一步：试验动物选择原则：
1. 种属 因为小鼠繁殖力强，价廉易得，特别适用于需用大量动物的实验。
2. 年龄、体重 低龄动物对药物敏感，只用于慢性和观察生长发育的实验。老龄动物代谢缓慢，生理功能低下，仅用于老龄医学的研究。一般药理实验均采用成年动物。动物年龄的大小与其体重大体一致，成年小鼠为18~28克，所以我们选用体重为18~22克的活动正常，健康成年小鼠。
3. 性别 不同性别动物对药物的敏感性有一定差异，雌鼠对药物的敏感性稍大于雄鼠。所以如无特殊要求，雌雄各半。实验前禁食12小时。
第二步：探索剂量范围。根据前人经验及我们做的预实验，得知MLD 为100mg/kg，LD 100为200mg/kg
第三步：均衡随机分组。每小组取50只小鼠，称重，标号，随机分为5组，为了避免各组的实验误差，应先将雌雄鼠分开，然后分别随机分到各组，保证每组动物中雌雄小鼠数量相同，体重相近。
第四步：各组剂量计算。用寇氏法计算LD 50，各剂量组要求按等比级数排列。经过预实验，得知最大剂量也就是死亡率为100%的剂量为200mg/kg，最小剂量也就是死亡率为0%得剂量为100mg/kg，然后按照下列公式求出各组剂量间的比值，计算出各组剂量。
第五步：给药观察和记录。在各实验组剂量确定以后，即可给药，给药后观察动物的一般情况，并记录动物死亡时的症状和死亡时间，按新药报批要求，一般需观察7天，因为学生实验时间有限，所以我们今天只观察2个小时。2小时后，统计各组死亡率（用小数表示）。
第六步计算方法。经上述实验得出各组死亡率之后，按下列公式计算LD 50及其标准误和可信限。
LD 50=log-1[Xm–i(∑P –0.5)]
Xm ；I ； ∑P ；
LD 50的可信限=LD50(P+0.95)
=LD50±2.68LD 50 (P=0.99)
由于整个半数致死量实验比较繁琐，所需时间比较长，所以今天同学们作实验只需从第三步做起，也就是在已知MLD 和LD 100的情况下，求LD 50。做完实验后请同学们思考两道题。
在做实验之前，介绍一下小鼠的捉拿、标记及腹腔注射的方法。
小鼠牙长而尖锐，如果激怒它则容易被咬伤。所以捉拿时动作要轻缓，现用右手拎住小鼠尾巴放于粗糙面上，轻轻向后拉扯，再用左手的拇指及食指抓住其两耳之间及关颈部皮肤，然后将小鼠腹部上翻，用左手无名指和小指夹住尾巴使其固定。
腹腔注射，左手将鼠固定，并使其头低尾高，右手持注射器将针头穿过腹壁肌肉注入腹腔，有落空感为准，注入药物之前先回抽一下，如感到有负压，没有血液则可给药。
标记用黄色苦味酸涂于毛上标号。将背部分前肢、腰部、后肢的左、中、右共九个区域，从左到右为1~9号，另将面部的左、中、右三个区域分别为10、20、30。
注意事项：
1．捉拿小鼠时，切勿用力过猛。要抓皮肤，而不是整个颈部，否则容易造成小鼠窒息。
2．腹腔注射时要注意针头不要刺入太深，以免刺入肠腔等脏器，也不要太浅，否则会形成皮下注射，注射部位也不要太高，以免损伤肝脏，也不要太低，否则会刺入膀胱。
3．要注意保持实验室的环境整洁。不准拿走实验桌上的器械。
药物介绍：利多卡因为酰胺类中效局麻药，具有起效快、穿透性强、弥散广、无明显扩张血管作用的特点。血液吸收后或静脉给药对中枢神经系统有明显的兴奋和抑制双相作用，血药浓度较低时，出现镇痛和嗜睡、痛阈提高，随着剂量加大，作用或毒性增强，亚中毒血药浓度时有抗惊厥作用；当血药浓度超过一定限度时则可诱发惊厥，继续增加剂量可致死亡。惊厥是主要致死的原因之一。
结果记录表
组别 剂量(D)
(mg/kg)
1
2
3
4 动物数(n) (只) 死亡数(F) (只) 死亡率%(P) (F/n)
5 6
计算LD 50及95％可信限：
LD 50=lg-1[Xm -I(∑P-0.5)]
式中，X m =最大剂量的对数值；I=相邻两组比值的对数(lgr)；P=各组死亡率；∑P=各组死亡率总和。
LD 50的95％平均可信限=LD50±4.5LD 50.S X50
其中S X50为LD 50的标准误
S X50=I. √∑P(1-P)/(n-1)
其中，n=各组动物数
(1)启动微机，运行BL-410程序，进入其数据处理选项，再进入半数致死量选项。
(2)一次输入各组剂量、动物总数、动物死亡数等相关数据。
(3)单击“计算”按钮计算LD50等参数。
【注意事项】
1. 药物称量、配制及给药的准确程度是本实验成功与否的关键。
2. 实验过程中给药剂量一定要准确。
3. 注意观察中毒症状及其发生时间、死亡时间。
4. 禁食的目的：残留食物影响小鼠体重，影响给药剂量的准确性；残留食物影响胃肠道对药物的吸收作用（主要是经口给药）。