１０５０
文章编号：１００９－０００２（２００７）０６－１０５０－０３
ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２００７
生物技术通讯
综述
丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
姜天一，朱平
中国医学科学院，协和医科大学药物研究所生物合成室，北京１０００５１［摘要］
丝状真菌，俗称霉菌，在食品工业中被用于生产多种生物酶和有机酸。近年来，人们发现丝状真菌具有分泌量大、
表达的蛋白有天然活性等特点，非常适合作为同源和异源重组蛋白的表达宿主，因此被广泛研究和探讨。简要综述了以黑曲霉为代表的几种常被用作蛋白表达宿主的丝状真菌的特点、应用中的主要问题和基本解决方案，以及近年关于丝状真菌表达系统的最佳培养条件和发酵条件的研究进展。［关键词］
丝状真菌；黑曲霉；异源表达
［中图分类号］
Ｑ７８C Ｑ９４９．３２７．１［文献标识码］Ａ
ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＦｕｎｇｉ
ＪＩＡＮＧＴｉａｎ－ｙｉ，ＺＨＵＰｉｎｇ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＰｅｋｉｎｇＵｎｉｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５１，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｐｒｏｄｕｃｉｎｇｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｎｄｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｓｏｍｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｓｐａｃｅｓｏｆｆｉｌａ－
ｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｂａｓｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｔｈｅｐｕｔａｔｉｖｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎ－ｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｉｎｔｈｅｅｎｄ，ｔｈｅａｕｔｈｏｒｒｅｖｉｅｗｅｄｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｎｈｅｔ－ｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］
ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉC ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒC ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
长久以来，丝状真菌不仅在饮料、奶酪等食品工业和酶的商业化生产中被广泛使用［１，２］，同时也由于其在商业领域的重要地位而得到长期深入的研究。丝状真菌的一些重要特性已逐渐被胞外分泌率高、蛋白质分人们所认识，这些特性包括表达量大、
子折叠和修饰系统接近高等真核细胞、生产的外源蛋白具有天然活性等［３］。因此，丝状真菌很快成了颇具吸引力的可用于生产异源重组蛋白的表达宿主系统
［４，５］
１选择丝状真菌自身的强启动子
为使异源蛋白能够过量表达，往往选用一些宿主自身的强
启动子来进行调控。
报道最多的是ｃｂｈ１启动子。ｃｂｈ１启动子启动木霉菌属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）的Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因的转录。曾有研究表明，用Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ发酵生产以外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ为主的纤维素酶，产量能达到４０ｇ／Ｌ，是Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ胞外分泌性蛋白总量的５０％，比一般细菌高出好几百倍［１０］。ｃｂｈ１启动子在Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ中最大有效个数为３个，即超过３个启动子拷贝不会继续增加目的蛋白产率，其原因可能是特异性识别启动子的反式作用因子有限，只能保证一定量的启动子被识别［１１］。但研究表明，这个启动子在黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）中则表现为拷贝数越多增强效果越明显［１２］。最近对Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ中木聚糖酶表达调控机制的研究表明，其中的调控机制非常复杂［１３，１４］。因此，意图通过过量表达转录调节蛋白来无限地增加ｃｂｈ１启动子启动效率的方法是不现实的［１５］。但在黑曲霉中情况却相对简单。ｇｌａＡ启动子是黑曲霉作为异源表达宿主时普遍使用的强启动子［１６，１７］，它是黑曲霉的葡萄糖淀粉酶启动子，能够得到产量非常高的葡糖淀粉酶［６］。现已阐明，ＡｍｙＲ和ＣｒｅＡ分别是这个启动子的正向和反向调节蛋白
［１８］
。
丝状真菌卓越的表达和分泌能力一直是吸引人们的最大特点。丝状真菌中的曲霉属和赤霉属的一些种，在理想的培养条件下发酵分泌葡糖淀粉酶的产率可达２０ｇ／Ｌ发酵液，分泌纤维素酶可达到４０ｇ／Ｌ发酵液，并具有真核分泌机制，很可能还具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能，如高甘露糖型和Ｎ－糖基难溶的化等［７］。相比较而言，细菌表达的蛋白质往往以无活性的、包涵体形式存在。因此可以认为，丝状真菌具有成为理想的表达宿主的潜力。但是在使用丝状真菌作为宿主表达外源蛋白，尤其是非丝状真菌蛋白时，其分泌效率往往不尽如人意，产率一般比表达同源蛋白低２到３个数量级。
为了使丝状真菌表达分泌异源蛋白的量与表达同源蛋白达到相当的水平，研究者进行了多方面的努力，分别通过不同的途径提高异源蛋白的表达量和分泌量。这些途径主要包括：①选择以丝状真菌自身的强启动子构建的表达盒来表达外源基因［８］；②通过构建融合蛋白提高异源蛋白的分泌水平；③抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统，以降低对异源蛋白的水解［９］；④优化发酵条件和改变发酵方式。
［４］
［３］
［６］
，通过改变这些反式因子的表达水平，即可影响
［收稿日期］２００７－０４－０３
［作者简介］姜天一（１９８１－），男，硕士研究生［通讯作者］朱平，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈｕｐｉｎｇ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ
姜天一等：丝状真菌异源蛋白表达系统研究进展
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讨，以便于寻找适合用作表达宿主的真菌株系。
在这些研究中，具有突破性进展的是Ｄｕｎｎ－Ｃｏｌｅｍａｎ等发现丝状真菌自身表达的蛋白酶能够明显影响异源蛋白的产量［２８］，而不同的丝状真菌和同种真菌不同株系表达的蛋白酶谱有很大不同。可以根据此特点，选择不同的种株系用于表达不同的目的蛋解决这个问题的另一种方法是通过诱变或基因敲除等技术白［２９］。
中国科学院微生筛选出特异的蛋白酶缺陷的丝状真菌突变株［３０］。
物研究所的刘丽等利用自外诱变技术成功筛选出一株酸性蛋白酶活性缺陷的黑曲霉菌株，其生长特性和糖化能力与一般菌株无异，但其胞外酸性蛋白酶活性只有正常菌株的０．７６％。他们还利用ｖｈｂ报告基因比较这株黑曲霉在转录和分泌水平上的差异，结果显示，ＶＨＢ的分泌量与酸性蛋白酶活性成明显的负相关性［３１］，蛋白酶缺陷型菌株表达量比出发菌株量增加了约５００％。由此可见，在某些时候宿主分泌的蛋白酶系是决定异源表达成败的关键因素。
ｇｌａＡ的启动转录效率。还有一些常用的启动子，如构巢曲霉（Ａ．
受乙醇、乙胺和酮类物质诱ｎｉｄｕｌａｎｓ）的持家基因ｇｐｄＡ启动子、
导的ａｌｃＡ／ａｌｃＲ启动子，都已被成功地用作异源蛋白在丝状真菌阿根廷科学家研究发现［２１］，用来自粗表达系统的有效启动子［１９，２０］。
糙链孢霉的ｃｆｐ基因启动子在丝状真菌中表达异源蛋白时，其表达量受到碳源的控制，可以通过改变碳源来阻遏或诱导异源蛋白的产生。Ａｎｄｒｉｅ［２２］等使用来自Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａｔｒｉｔｉｃｉｒｅｐｅｎｔｉｓ（属于半知菌亚门）的ＴｏｘＡ和ＴｏｘＢ启动子异源表达了多种报告基因，并详细阐述了ＴｏｘＡ和ＴｏｘＢ作为丝状真菌异源表达启动子的潜力，为今后使用这２种启动子提供了基础。
２构建融合蛋白
使丝状真菌生产的蛋白能够分泌到细胞外，不仅便于分离
纯化，也有利于蛋白的累积。丝状真菌表达的很多自身的蛋白能够高效分泌到胞外［２３］。利用这个特性，可用异源基因取代某个分泌性良好的同源蛋白基因的３＇端，表达出融合蛋白，用这个丝状真菌自身的蛋白作为载体将目的蛋白“运出”细胞。这种方法能使异源蛋白的分泌量提高５～１００倍［４］。Ｗａｒｄ等最先报道了使用基因融合技术提高蛋白产量的方法。他们通过将黑曲霉编码葡糖淀粉酶的基因和牛凝乳酶的基因相融合，发现通过融合基因表达的凝乳酶产量大大超过单纯异源表达的未融合的凝乳酶［２４］，并且融合蛋白在分泌到胞外后会自动水解，产生凝乳酶。随着研究的深入和基因融合技术的成熟，现在大多数融合蛋白表达操作只使用葡糖淀粉酶的催化结构域融合目的蛋白，表达的融和蛋白可用蛋白水解酶特异性水解Ｎ端氨基酸序列，得到目的蛋白产物［２５］。
通过基因融合表达融合蛋白的方法虽然得到了广泛的应用，但是其背景知识仍然不是很清楚，也有一些试图通过融合基因提高表达量但不成功的例子［２６］。尽管如此，基因融合仍然是提高曲霉中异源基因表达量的首选办法。
４形态学因素
不同的培养方法产生的丝状真菌具有不同的形态，其分泌
效率也不同。其中一个原因是菌体生长改变了培养液的流动性，造成营养物质和氧气在发酵罐中梯度分布；另一个原因是不同生长形态往往导致不同的生物量。几种常见的丝状真菌与其相应的发酵形态见表１。有人在研究了产黄青霉药瓶培养产生的菌球后发现，小于４００μｍ的菌球全部由具有代谢活性的活细胞组成；而直径更大一些的菌球则分成４个区域，最外层是具生长活性的菌丝，接下来是２层代谢活性依次减弱的细胞，最里面是空不心层［３２］。还有人研究了黑曲霉ＡＢ４．１菌株在不同培养系统中、同菌体形态时蛋白质分泌产量的变化，比较了几种发酵系统，发现其目的蛋白葡糖淀粉酶－ＧＦＰ的产量在固定化细胞培养系统中得率最高，而在传统的药瓶培养系统中得率最低，两者相差１０倍；并因此推测，异源蛋白的合成和分泌主要发生在菌丝尖端生长的过程中［３２，３３］。
３抑制丝状真菌自身的蛋白酶系统
５
为了能在丝状真菌中过量表达异源蛋白，可采用融合表达技术、使用真菌特异的强启动子，有时甚至还用高拷贝数的强启动子，但有时仍然不能获得高的异源蛋白产量。有研究显示，在很多情况下，异源蛋白基因的转录水平并未受到影响，问题仅仅应该对丝状真菌分泌途径进行深入探在于分泌途径和分泌后［２７］。
内质网因素
大多数蛋白需要在内质网中经过正确折叠后才具有生物活
性，没有正确折叠的蛋白会滞留在内质网中或者被降解清除。细胞自身具有蛋白质折叠的质量控制机制，这使得未能正确折叠内质网的这种“校读（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）”功的蛋白不能分泌到胞外［３５］。
表１部分丝状真菌代谢产物生产与菌体形态之间的关系［３３］
真菌种类
桃色顶孢（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｉｃｉｎｕｍ）
出芽短梗霉菌（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍｐｕｌｌｕｌａｎｓ）
泡盛曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉ）黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）土曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）
顶头孢（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）顶头孢（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）粗糙脉孢霉（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ）产黄青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）
无根根霉菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ）木霉属Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ
代谢产物
代谢产物生产的菌体形态
球菌
厚生孢子，但细胞芽生孢子，单细胞和丝状体
自由伸展的丝状体
球菌
分散的丝状体直径０．１～０．５ｍｍ的球菌
从菌丝到节孢子从膨胀的菌丝到节孢子具绒毛状的小菌球
直径４００～５００μｍ的菌球，丝状菌丝体上的非生长区域
菌丝体
菌丝体上的非生长区
β－葡聚糖支链淀粉葡萄糖淀粉酶
枸橼酸淀粉酶亚甲基丁二酸β－内酰胺类抗生素
头孢菌素Ｃ酸性磷酸酯酶
青霉素延胡索酸γ－癸内酯
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能成为大量表达异源蛋白的障碍之一。在如何能够提高内质网的加工能力和如何解释其中的分子机制方面，Ｒａｄｅｎ等做了较为深入的研究［３５，３６］，并且提出了新的模型来解释他们的研究结果。
ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ．１８Ｎｏ．６Ｎｏｖ．，２００７
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生物技术通讯
６现状与展望
在成功地表达了多种同源、异源蛋白之后，丝状真菌作为表
达系统的优良特性得到了很好的表现。但是仍有一些蛋白，尤其是非丝状真菌蛋白，在此表达系统中尚无法达到合理的产量，甚至根本不表达，其原因目前还不清楚，可能与文中总结的某个或某几个因素有关，也可能还有其他未知的因素。可以看出，对丝状真菌的分子生物学和生理生化的研究还有待深入。不过从丝状真菌目前已经表现出的优良特性来看，我们完全有理由相信：随着对丝状真菌认识的不断深化，配合更加先进的分子生物学技术手段，丝状真菌在作为异源表达宿主方面的应用前景会非常广阔。
参考文献
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