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染色法、培养基和（微生物检验） 染色法、培养基和（微生物检验）试剂配制作业指导书1 目的 对染色法、培养基和试剂配制方法作出明确规定，为检测结果的准确性提供最 基本的保证。 2 范围 适用于微生物检验。 3 职责 3.1 微检人员负责培养基、试剂配制。 3.2 微检人员掌握微生物的染色方法。 4 培养基和试剂配制名称、用途 培养基和试剂配制名称、 配制名称名称 4.1 革兰氏染色液 4.2 营养琼脂 4.3 孟加拉红培养基 4.4 乳糖胆盐发酵管 4.5 乳糖发酵管 4.6 三糖铁琼脂 4.7 伊红美兰琼脂 4.8 缓冲蛋白胨水 4.9 四硫酸钠煌(TTB)绿增菌液 4.10 GN 增菌液 微生物染色 细菌培养和细菌总数测定 霉菌、酵母菌计数 大肠菌群，粪大肠菌群及大肠杆菌的测定 供大肠菌群证实试验用 肠杆菌科细菌的生化反应筛选 分离肠道致病菌。 沙门氏菌检验中的前增菌 沙门氏菌检验中的前增菌 志贺氏菌的前增菌 用途第 2 页 共 16 页
4.11 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 4.12 SS 琼脂 4.13 V-P 半固体琼脂 4.14 7.5%氯化钠肉汤 4.15 Baird-Parker 培养基 4.16 酸性肉汤 4.17 尿素琼脂基础 4.18 赖氨酸脱羧酶培养基 4.19 吲哚培养基 4.20 硝酸盐氰化钾培养基 4.21 生理盐水沙门氏菌选择性增菌培养 沙门氏菌、志贺氏菌的分离 细菌检验的 V-P 试验 金黄色葡萄球菌的增菌培养 金黄色葡萄球菌的检验 酸性罐头食品商业无菌检验 细菌检验中的尿素酶试验 细菌检验中的赖氨酸脱羧酶试验 细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤 细菌检验中的硝酸盐还原试验和氰化钾试验 检样的溶解与稀释5 具体内容 5.1 革兰氏染色法 5.1.1 革兰氏染色液 5.1.1.1 结晶紫染色液 成份： 结晶紫 95%乙醇 1%草酸铵水溶液 5.1.1.2 革兰氏碘液 成份： 碘 碘化钾 蒸馏水 1.0g 2.0g 300.0ml 1.0g 20.0ml 80.0ml第 3 页 共 16 页
5.1.1.3 95%乙醇 5.1.1.4 沙黄复染液 成份： 沙黄 95%乙醇 蒸馏水 5.1.2 染色法 5.1.2.1 将涂片在火焰上固定。 5.1.2.2 初染：滴加结晶紫染色液，染 1min，水洗。 5.1.2.3 媒染：滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。 5.1.2.4 脱色：滴加 95%乙醇脱色，水洗；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再 用乙醇滴满整个涂片，脱色 10s，水洗。 5.1.2.5 复染：滴加沙黄复染液，染 1min，水洗，待干，镜检。 5.1.2.6 结果判定：革兰氏阳性菌呈紫色；革兰氏阴性菌呈红色。 5.2 一般培养基和专用培养基 5.2.1 营养琼脂 5.2.1.1 用途：用于一般细菌培养及细菌总数测定。 5.2.2.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 牛肉粉 氯化钠 琼脂 PH7.3±0.1 5.2.2.3 制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15 min第 4 页 共 16 页0.25g 10.0ml 90.0ml10.0 3.0 5.0 15.0
高压灭菌备用。 5.2.2.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.2 孟加拉红培养基 5.2.2.1 用途：用于粮食、食品、饮料中霉菌、酵母菌计数。 5.2.2.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 孟加拉红 氯霉菌 琼脂 5.0 10.0 1.0 0.5 0.03 0.1 15.05.2.2.3 制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃20 min 高压灭菌备用。 5.2.2.4 注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。 5.2.3 乳糖胆盐发酵管 5.2.3.1 用途：用于大肠菌群，粪大肠菌群及大肠杆菌的测定。 5.2.3.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 胆盐 乳糖 溴甲酚紫 20.0 3.0 5.0 0.01第 5 页 共 16 页
PH7.4±0.1 5.2.3.3 制法: 称取各成份溶于纯水中， 加热煮沸至完全溶解， 分装于有倒立发酵管 的试管中，115℃15min 高压灭菌，双料乳糖胆盐发酵管除纯水外，其它成份加倍。 5.2.3.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。 5.2.4 乳糖复发酵管 5.2.4.1 用途：供大肠菌群证实试验用。 5.2.4.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 乳糖 溴甲酚紫 PH7.4±0.1 5.2.4.3 制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装 10ml 于有倒立 发酵管的试管中，115℃15min 高压灭菌备用。 5.2.4.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。 5.2.5 三糖铁琼脂 5.2.5.1 用途：主要用于肠杆菌科细菌的生化反应筛选。 5.2.5.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 牛肉膏 乳糖 蔗糖 琼脂 20.0 3.0 10.0 10.0 12.0 PH7.4±0.1第 6 页 共 16 页20.0 10.0 0.01酚红 氯化钠0.025 5.0硫酸亚铁铵(6H2O) 0.5 硫代硫酸钠 葡萄糖 0.5 1.0
5.2.5.3 制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，115℃15min 高压灭菌制成高层斜面备用。 5.2.5.4 注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。 5.2.6 伊红美兰琼脂 5.2.6.1 用途：弱选择性培养基，用于分离肠道致病菌。 5.2.6.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钾 琼脂 伊红 美兰 PH7.1±0.2 5.2.6.3 制法: 称取各成份溶于纯水中， 加热溶解， 121℃15min 高压灭菌， 冷至 55℃ 倾注平板备用。 5.2.6.4 注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。 5.2.7 缓冲蛋白胨水 5.2.7.1 用途：用于沙门氏菌检验中的前增菌。 5.2.7.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 氯化钠 Na2HPO4(12H2O) KH2PO4 10.0 5.0 9.0 1.5第 7 页 共 16 页10.0 10.0 2.0 15.0 0.4 0.065
最终 PH7.2±0.1 5.2.7.3 制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶 225ml， 121℃15min 高压灭菌备用。 5.2.7.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。 5.2.8 四硫酸钠煌 四硫酸钠煌(TTB)绿增菌液 绿增菌液 5.2.8.1 用途：用于沙门氏菌检验中前增菌。 5.2.8.2 成份（g/L） ： A 基础培养基 多胨或胨 胆盐 碳酸钙 硫代硫酸钠 蒸馏水 B 碘溶液 碘 碘化钾 蒸馏水 5.0g 6.0g 20ml 5.0g 1.0g 10.0g 30.0g 1000ml5.2.8.3 制法：将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶 100 ml。 分装时应随时震荡，使其中的碳酸钙混匀。121℃高压灭菌 15min 备用，临用时每 100 ml 基础培养基中加入碘溶液 2 ml、0.1%煌绿溶液 1 ml。 5.2.8.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。 5.2.9GN 增菌液 5.2.9.1 用途：用于志贺氏菌的前增菌液第 8 页 共 16 页
5.2.9.2 成份（g/L） ： 胰蛋白胨 葡萄糖 甘露醇 柠檬酸钠 去氧胆酸钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 氯化钠 蒸馏水 20.0 g 1.0 g 2.0 g 5.0 g 0.5 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1000ml5.2.9.3 制法:按上述成分配好，加热使溶解，校正 pH。分装每瓶 225 ml，115℃高 压灭菌 15min。 5.2.9.4 注意事项：密封保存于阴凉干燥处。 5.2.10 亚硒酸盐胱氨酸增菌液 5.2.10.1 用途：用于沙门氏菌选择性增菌培养。 5.2.10.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钠 亚硒酸氢钠 L-胱氨酸 PH7.0±0.1 5.2.10.3 制法: 称取各成份溶于灭菌纯水中， 在无菌容器中溶解， 分装， 每瓶 100ml，第 9 页 共 16 页5.0 4.0 10.0 4.0 0.1
备用。 5.2.10.4 注意事项：于 4℃冰箱中密封保存。5.2.11 SS 琼脂 5.2.11.1 用途：用于沙门氏菌、志贺氏菌的分离。 5.2.11.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 乳糖 柠檬酸铁 中性红 琼脂 5.0 10.0 10.0 0.025 15.0 牛肉粉 三号胆盐 柠檬酸钠 硫代硫酸钠 煌绿 PH7.0±0.1 5.2.11.3 制法: 称取各成份溶于纯水中， 加热煮沸溶解， 冷至 55℃， 倾注平板备用。 5.2.11.4 注意事项：A 保存于阴凉干燥处，密封、避光。 B 勿高压灭菌。 5.2.12V-P 半固体琼脂 5.2.12.1 用途：用于细菌检验的 V-P 试验。 5.2.12.2 成份（g/L） ： 蛋白胨 酵母膏 葡萄糖 氯化钠 琼脂 12.0 1.0 10.0 5.0 3.0第 10 页 共 16 页5.0 3.5 8.5 8.5 0.00033
PH7.3±0.1
5.2.12.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，每管1～1.5ml，121℃10min高压灭菌，立即取出冷却备用。
5.2.12.4配制试剂：
甲液： α-萘酚 6.0g
无水乙醇溶液 100.0ml
乙液： 氢氧化钾 40.0g
肌酸 0.3g
蒸馏水 100.0ml
先将氢氧化钾溶于水中，再加入肌酸。
甲液和乙液保存于4℃冰箱内，可使用2个月。
5.2.12.5试验方法：挑取琼脂培养物接种V-P培养基中，于36±1℃培养24h±2h，将甲液0.2ml（约6滴）加入试管中，摇混均匀，再加入乙酸0.1ml（约3滴），再摇混均匀。
阳性反应立即或15min内呈现红色，阴性反应为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。
5.2.12.6注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。
5.2.13 7.5%氯化钠肉汤
5.2.13.1用途：用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。
5.2.13.2成份（g/L）：
蛋白胨 10.0
牛肉粉 3.0
氯化钠 75.0
PH7.4±0.1
5.2.13.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶50ml，121℃15min高压灭菌备用。
5.2.13.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。
5.2.14 Baird-Parker培养基
5.2.14.1用途：用于食品中金黄色葡萄球菌的检验。
5.2.14.2成份（g/L）：
胰蛋白胨 10.0 丙酮酸钠 10.0
牛肉膏 5.0 甘氨酸 12.0
酵母膏 1.0 氯化锂(6H2O) 5.0
琼脂 20.0 PH7.4±0.1
5.2.14.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装每瓶95ml，121℃15min高压灭菌，冷至50℃时，每95ml加入5ml亚碲酸钾卵黄增菌液。
5.2.14.4注意事项：A保存于阴凉干燥处，密封、避光。
B平板冰箱贮存不超过48小时。
5.2.15酸性肉汤
5.2.15.1用途：用于酸性罐头食品商业无菌检验。
5.2.15.2成份（g/L）：
多价蛋白胨 5.0
酵母粉 5.0
葡萄糖 5.0
磷酸氢二钾 4.0
PH5.0±0.2
5.2.15.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃20 min高压灭菌备用。
5.2.15.4注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。
5.3生化试验培养基和试剂
5.3.1尿素琼脂基础
5.3.1.1用途：用于细菌检验中的尿素酶试验。
5.3.1.2成份（g/L）：
蛋白胨 1.0
葡萄糖 1.0
氯化钠 5.0
磷酸二氢钾 2.0
酚红 0.012
琼脂 15.0
PH6.8±0.1
5.3.1.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌，冷至55℃以无菌技术每95ml溶液加入40%尿素水溶液5ml，混匀后制成斜面备用。
5.3.1.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，观察结果。尿素酶阳性者出于产碱而使培养基变为红色。
5.3.1.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。
5.3.2赖氨酸脱羧酶培养基
5.3.2.1用途：用于细菌检验中的赖氨酸脱羧酶试验。
5.3.2.2成份（g/L）：
酵母膏 3.0
葡萄糖 1.0
L-赖氨酸 5.0
溴甲酚紫 0.016
PH6.7±0.1
5.3.2.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管1-1.5ml，121℃15min高压灭菌备用。
5.3.2.4试验方法：从琼脂斜面上挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养18-24h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者出于产碱而使培养基变为紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变黄色。对照管应为黄色。
5.3.2.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。
5.3.3吲哚培养基
5.3.3.1用途：用于细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤。
5.3.3.2成份（g/L）：
蛋白胨 10.0
氯化钠 5.0
DL-色氨酸 1.0
PH7.4±0.1
5.3.3.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌备用。
5.3.3.4配制柯凡克试剂：对二甲氨基苯甲醛 10.0g
戊醇 150.0ml
浓盐酸 50.0ml
将色泽鲜明干燥的对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，缓慢搅拌加入盐酸，加热至
60℃，呈深黄色，静置6-7h，变成黄色即可使用。试剂宜少量配制，不用时保存于4℃冰箱内。久存后试液变成褐色不可使用。
5.3.3.5试验方法：挑取琼脂培养物接种，在36±1℃培养24h，滴加柯凡克试剂0.1ml。阳性反应出现红色环；阴性反应为黄色环。
5.3.3.6注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。
5.3.4硝酸盐氰化钾培养基
5.3.4.1用途：用于细菌检验中的硝酸盐还原试验和氰化钾试验。
5.3.4.2成份（g/L）：
蛋白胨 10.0
氯化钠 5.0
磷酸二氢钾 0.225
磷酸氢二钠 5.64
硝酸钾（无亚硝酸盐）1.0
5g/L氰化钾溶液 10.0
PH6.8±0.1
5.3.4.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15min高压灭菌，每100ml无菌加入0.5%氰化钾溶液1ml，分装无菌试管备用；同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。
5.3.4.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，先接种于吲哚培养基中，混匀，然后灼烧接种环，再沾取吲哚培养基少许接种于氰化钾培养基中，于36±1℃培养24h，观察培养液有无混浊，培养液出现混浊，即有细菌生长，为阳性反应（不抑制）；经2天培养，细菌不生长为阴性反应（抑制）。
5.3.4.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。
5.3.5生理盐水
5.3.5.1用途：用于检样的溶解与稀释。
5.3.5.2成份：（g/L）：
氯化钠 8.5g
纯水 1000.0ml
5.3.5.3制法：称取氯化钠于纯水中，至完全溶解，分装，
121℃高压灭菌15min。