生物技术实践
第1讲 微生物的利用
1．下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答下列问题。 A. 配制 培养基→B. 灭菌→C. 扩大培养 液体培养基 →D. 划线分离 和培养 固 体培养基 →E. 菌种 保存
(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为________培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持________。对培养基酸碱度的调节，应该在B 过程的________(前面或后面) 。
(2)D过程与C 过程相比，培养基中增加的物质是________。E 过程所需的温度是________。
(3)D过程后，一个菌体便会形成一个________，这种分离方法是________的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。
(4)植物组织培养时，先配制MS 培养基，再加入一定比例的植物激素，当生长素相对较多时，可促进________。
(5)植物组织培养和微生物培养都需要无菌操作，下列不适宜用高压蒸汽灭菌的是________。
A ．接种环和镊子
B ．三角瓶和广口瓶
C ．发芽培养基和生根培养基
D ．用于培养的幼茎和幼芽
解析 LB 液体培养基是通用的细菌培养基，LB 固体平面培养基则用于划线分离，氯化钠充当溶质的作用是维持培养基的渗透压，调整好酸碱度后才能进行灭菌，若灭菌后再进行调整酸碱度的话，又会产生新的污染。在液体培养基的基础上加入一定量的琼脂就成了固体培养基，培养好后的菌种置于
4 ℃冰箱中保存。通过划线分离后一个菌体就会繁殖出一个菌落。植物组织培养中生长素多，有助于生根，而细胞分裂素多，则利于生芽。高压蒸汽灭菌常用于培养基、培养器材等的灭菌，而用于培养的幼茎和幼芽则不能进行任何的灭菌操作，否则会导致细胞死亡。
答案 (1)LB 渗透压 前面 (2)琼脂 4 ℃ (3)(单) 菌落 消除污染杂菌(纯化菌种)
(4)生根 (5)D
2．急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌和病毒通过消化道进入人体导致的。因此检验饮用
水的细菌含量和病毒含量是有效监控疾病发生的必要措施，请回答下列与检验饮用水有关的问题。
(1)检验大肠杆菌的含量时，通常将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，记录菌落数量，这种方法称为________________________。在下面所示的四种菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是________。
(2)用该方法统计样本菌落数时是否需要设置对照组？________。为什么？_________。
(3)已知大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，现提供足量的已灭菌的乳糖蛋白胨培养液和具塞试管，应如何判断待检水样中是否含有大肠杆菌？________。
解析 纯化大肠杆菌的方法——稀释涂布平板法和平板划线法。删除偏差太大的数据，对剩下的多个培养数据进行平均处理就可以得到水样中的大肠杆菌数。大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，通过密封培养，大肠杆菌可以进行厌氧呼吸产生气体，以气泡的形式释放出来。
答案 (1)稀释涂布平板法 D (2)需要 因为需要判断培养基是否被杂菌污染(培养基灭菌是否合格)
(3)通过无菌操作向试管内注入一定量待检水样，再注入已灭菌的乳糖蛋白胨培养液将试管充满，塞上塞子，混匀后置于37 ℃恒温箱培养24 h。若试管内有气泡生成，则说明水样中有大肠杆菌
3．尿素是一种高浓度氮肥且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。
某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：
(1)________。写出细菌分解尿素的方程式______。
(2)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？________(能/不能) ，原因是_________。
(3)分离得到分解尿素的细菌后，如果要扩大培养，则应选择__________培养基进行培养。培养一段时间后，使用________对微生物细胞进行计数。计数过程中，下列哪种行为会影响计数的准确性________。
A ．计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数
B ．如果方格内微生物细胞数量多于300个，培养液先稀释后再计数
C ．如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞
D ．压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数
(4)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用________技术。
解析 (1)含有脲酶的细菌通过降解尿素为氨获得生长的氮源，从而也起到维持生物圈中氮元素平衡的作用。(2)从培养基的成分看因为含有琼脂，所以不能分离出分解尿素的细菌，因为琼脂是一种未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。(3)扩大培养需要使用液体培养基，对微生物或者酵母菌等进行计数时常用血细胞计数板。计数过程需要注意操作规范，如A 选项所述的操作会影响计数的准确性，应该把试管上下倒转数次，使细菌分布均匀后取样。(4)固定化酶技术可以提高酶的利用率。
答案 (1)脲酶 参与了氮循环(或维持氮平衡)
脲酶CO(NH2) 2＋H 2O ――→2NH 3＋CO 2(分子式、符号、条件缺一不可) (2)不能 琼脂是未被纯
化的混合物，内含一定的含氮化合物，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物 (3)液体 血细胞计数板 A (4)固定化酶
4．为了探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌) 。培养基成分如下表所示，实验步骤如下图所示。请分析回答问题。
(1)简述_____________。
(2)培养基中加入尿素的目的是筛选________，这种培养基属于
________培养基。
(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的
________和________，该实验需要振荡培养，原因是_____________。
(4)转为固体培养基时，常采用________接种，获得单菌落后继续筛选。
(5)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理，才能倒掉。
解析 本题考查从土壤中分离分解尿素的细菌的方法。解题时，应从分解尿素的细菌的代谢特征入手，对整个过程中需要控制的环境条件进行分析。尿素是培养基中的唯一氮源，因此原则上只有能够利用尿素的微生物才能够在此培养基上生长。由于细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH 升高，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入的酚红指示剂将变成红色；这种培养基属于选择培养基，可筛选目的菌；目的菌生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖；振荡培养的目的是提供充足的氧气；固体培养基培养时的接种方法常用稀释涂布平板法或平板划线法；倒掉培养基之前应对其进行灭菌处理。
答案 (1)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH 升高，使酚红指示剂变为红色 (2)目的菌 选择 (3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (4)稀释涂布平板法(平板划线法) (5)灭菌
5．下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题。
(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用______________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。
(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？
_____________________________。
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
______。
(4)右图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接
种方法是________(填图甲或图乙) 。
解析 图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环、涂布器。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域。因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。 答案 (1)平板划线 稀释涂布平板 接种环 涂布器 灼烧灭菌 (2)火焰附近存在着无菌区域 (3)避免培养过程产生的水分影响微生物的生长 (4)图乙