蔗糖，淀粉，可溶性总糖测定
0.1g干样（过100目筛） 8ml 80%乙醇 80℃水浴30 min 冷却
冷却
加2ml蒸馏水
沸水浴20min，不断搅动
0.1ml 2N NaOH
沸水浴10min
4ml0.2%蒽酮试剂（用浓H2SO4配制）摇匀
冷却
冷却 15min沸水浴 2ml 9.2N HClO4
1ml 0.1%间苯二酚 10min不断振荡
3ml 10N HCl 加水6ml
冷却
比色OD620
（方法同可溶性总糖）
弃去
我们也是在使用同样的方法做同样的样品。
1：保证每管中加入的5ml（可以使用大肚管）0.2%蒽酮硫酸溶液与3.0ml（可以使用5ml的刻度管，但是必须标定）必须准确！
2：保证每管的反应时间是完全的6分钟（拿秒表来计算，差异为正负3秒），这个可以两个人进行配合。 3：振荡时尽量使溶液混合均匀，如果在较短的时间没法混合均匀，建议振荡40秒—1分钟。 4：从振荡开始计算，到吸收度测定结束的时间至，必须控制在30分钟以内（标准规定是20-40分钟）。
5：0.2%蒽酮硫酸溶液必须在实验前就配制好，由于硫酸的密度较大，建议在样品配制好以前1小时配制好，加入试管时一定要摇匀。
6：为了保证试验的准确度，建议每个样品平行测定3-4管，这样的话可以消除由于自己的操作失误造成的试验结果不准确！
以上几点时我在实验中发现并及时注意的几点经验，希望对楼主有所帮助！
1. 葡萄糖标准曲线的制作：
准确称取0.1000g(在85℃烘箱中烘2小时)葡萄糖，溶解并定容至1000ml，即成0.1mg/ml葡萄糖母液，按下表分别吸入20ml具塞刻度试管中 0.1mg/ml葡萄糖母液（ml）
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水(ml)
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
葡萄糖(ml/管)
0.0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20
以下操作同可溶性糖的测定
2. 蔗糖标准曲线的制作：
准确称取0.1000g(在85℃烘箱中烘2小时)葡萄糖，溶解并定容至1000ml，即成0.1mg/ml葡萄糖母液，按下表分别吸入10ml具塞刻度试管中
0.1mg/ml葡萄糖母液（ml）
0.0
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9
蒸馏水(ml)
0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
蔗 糖(ml/管)
0.0 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09
以下操作同可蔗糖的测定 3. 计算
从标准曲线上算得葡萄糖的mg数×稀释倍数 可溶性糖含量（mg/g）=
样品重（g）
从标准曲线上算得蔗糖的mg数×稀释倍数
蔗糖含量（mg/g）=
样品重（g）
从标准曲线上算得葡萄糖的mg数×稀释倍数×0.9
淀粉含量（mg/g）=
样品重（g）
实验24 植物组织中可溶性糖与淀粉的测定
植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
一、苯酚法测定可溶性糖
【原理】
植物体内的可溶性糖主要指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100μg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
【仪器与用具】
分光光度计；电炉；铝锅；20ml刻度试管；刻度吸管5ml 1支，1ml 2支；记号笔；吸水纸适量。
【试剂】
1．90%苯酚溶液 称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10ml溶解，在室温下可保存数月； 2．9%苯酚溶液 取3ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30ml，现配现用； 3．浓硫酸（比重1.84）；
4．1%蔗糖标准液 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；
5．100μg/ml蔗糖标准液 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。 【方法】
1．标准曲线的制作
取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
表24-1 各试管加溶液和水的量
然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2．可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
3．测定 吸取0.5ml样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。
可溶性糖含量(mg/g)= a－吸取样品液体积(ml)； V－提取液量(ml)； n －稀释倍数； W－组织重量（g）。
式中 C－标准方程求得糖量(μg)；
二、蒽酮法测定可溶性糖
【原理】
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比，故可用于糖的定量。
该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的末溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比
色。
【仪器与用具】 同方法一。 【试剂】
1．蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
2．浓硫酸（比重1.84）。 【方法】
1．标准曲线的制作
按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。
2．可溶性糖的提取同方法一第二步。
3．显色测定 吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。
4．计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。
三、3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖
【原理】
3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。
【仪器与用具】
25ml血糖管或刻度试管；大离心管或玻璃漏斗；100ml烧杯；100ml三角瓶；100ml容量瓶 ；刻度吸管 1ml、2ml、10ml；沸水浴；离心机（过滤法不用此设备）；电子天平；分光光度计。
【试剂】
（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。
【方法】
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支具有25ml刻度的血糖管或刻度试管，编号，按表24-2所示的量，精确加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。
将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5ml蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖mg为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。
表24-2 各试管加溶液和试剂的量
2．样品中还原糖的测定
（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100ml的烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）显色和比色：取3支25ml刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液2ml，3,5-二硝基水杨酸试剂1.5ml，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。分别在标准曲线上查出相应还原糖mg数，按下式计算还原糖百分含量：
还原糖（%）=
V－提取液的体积（ml）；
式中 C－标准曲线方程求得的还原糖mg数；
a－显色时吸取样品液体积（ml）； W－样品重（g）。
四、淀粉含量的测定
【原理】
淀粉是由葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热使其水解成葡萄糖，然后在浓硫酸的作用下，使单糖脱水生成糠醛类化合物，利用苯酚或蒽酮试剂与糠醛化合物的显色反应，即可进行比色测定。
【仪器与用具】
电子天平；容量瓶：100ml×4，50ml×2；漏斗；小试管若干支；电炉；刻度吸管0.5ml×1，2.0ml×3，5ml×4；分光光度计；记号笔。
【试剂】
（1）浓硫酸（比重1.84）；
（2）9.2mol/L HClO4；
（3）2%蒽酮试剂：同蒽酮法（或9%苯酚，同方法一）；
（4）淀粉标准液：准确称取100mg纯淀粉，放入100ml容量瓶中，加60～70ml热蒸馏水，放入沸水浴中煮沸0.5h，冷却后加蒸馏水稀释至刻度，则每ml含淀粉1mg，吸取此液5.0ml，加蒸馏水稀释至50ml，即为每ml含淀粉100μg的标准液。
【方法】 1．标准曲线制作
取小试管11支从0～10编号，按表24-3加入溶液和蒸馏水。
以下步骤按苯酚法或蒽酮法均可，见方法一或方法二，绘制相应的标准曲线。
表24-3 各试管加入标准液和蒸馏水量
2．样品提取
将提取可溶性糖以后的残渣，移入50ml容量瓶中，加20ml热蒸馏水，放入沸水浴中煮沸15min，再加入9.2mol/L高氯酸2ml提取15min，冷却后，混匀，用滤纸过滤，并用蒸馏水定容（或以2500r/min离心10min）。
3．测定 可采用苯酚法或蒽酮显色法测定。
按下式计算淀粉的含量。淀粉水解时，在单糖残基上加了1分子水，因而计算时所得的糖量乘以0.9才为扣除加入水量后的实际淀粉含量。
淀粉含量（%）=V－提取液总量（ml）； a－显色时取液量（ml）； W－样品重（g）。
式中 C－标准曲线查得的淀粉含量（μg）；
注：淀粉水解完全度试验 样品测定中可同时作1份用于淀粉水解完全度检验的样品，在酸解过滤后，将其残渣加上2ml水，搅拌均匀，吸2滴于白瓷盘上，加2滴I2-KI溶液，显微镜下观察，若出现紫蓝色颗粒，证明水解不完全，其正式测试样品需再加高氯酸水解，直至不出现蓝紫色为止。
【思考题】
1.简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。 2.干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样避免？