天蚕素类抗菌肽的抗菌性能测定及其性质研究
伍小松1, 罗振福1, 李俊波2, 杨丹丹1, 贺建华1, 范志勇1
(1. 湖南农业大学动物科技学院, 长沙 410128; 2. 湖南省唐人神研发中心, 株洲 412002)
摘要:本试验通过检测天蚕素类抗菌肽的抗菌性能及各项抗菌性质, 探究其对常见致病菌的抑制和杀灭作用。通过对抗菌肽抗菌性能及热稳定性的测定, 结果表明, 天蚕素类抗菌肽对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑制效果, 三者的最小抑菌浓度分别为4500、3500、3500μg /mL , 此外, 该产品耐热性和耐酸性效果较佳, 在100℃水浴15min 后或p H 为1时仍表现出对金黄色葡萄球菌的抗性。
关键词:天蚕素; 抗菌性能; 耐酸性; 耐热性
中图分类号:Q516 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009) 0220028205
抗菌肽具有较好的广谱抗菌性能, 相对于抗生素而言, 具有无残留、效价高、无毒害作用等优点, 抗生素潜在的替代品, 的热点之一。种, 早在20世纪70Boman 在(hy atop hora cecropi a ) 时分离得到。目前, 纯化的抗菌肽已被证明对各种革兰氏阳性菌和阴性菌有良好的杀灭作用, 但对于天蚕素类抗菌肽产品的抗菌性能目前鲜见报道。本试验试图通过一定抑菌试验检测其是否有同样的作用或性质, 为该类产品在畜牧业中的应用提供借鉴。1 材料与方法1. 1 试验菌株 试验用的大肠杆菌(Escherichiaco 2li ) 、沙门氏菌(S almonelladerby ) 、金黄色葡萄球菌(S tapylococcusaureur ) 、链球菌(S treptococcus suis ) 4
1. 1取适量抗菌肽产品
:5000、4500、
、3000、2500、2000、1500、1000μg/mL 。并将1000μg/mL 浓度的抗菌肽按倍比稀释法稀释成以下浓度:500、250、125、62. 5、31. 25、15. 625、7. 8125、3. 90625、1. 953125μg/mL , 前后共计18个浓度。
1. 3. 2 抗菌肽产品抗菌活性的测定
1. 3. 2. 1 纸片法测定抑菌活性 采用普通琼脂培
养基(陈玉萍,1996; 杨敬辉等,2006) , 菌液浓度在活化培养后稀释成106～107CFU/mL 。在无菌操作下, 注入加热融化的培养基20mL 于直径9cm 的培养皿中, 使其在底部均匀分布, 当冷却到不烫手时分别向每个培养皿中加入2mL 菌悬液, 摇匀, 凝固后, 在无菌操作条件下, 用镊子夹灭菌滤纸片(直径为6mm ) 放于培养皿上, 轻轻加压, 使其与平板培养基
种菌均由湖南农业大学动物医学院分离鉴定。1. 2 培养基 ①液体培养基:牛肉膏10g 、蛋白胨10g 、氯化钠5g , 加水定容至1000mL ,p H 7. 2, 1) 高压灭菌20min 。②固体培养×10Pa (121℃
5
接触无空隙, 然后用移液枪吸取20μL 3500μg/mL 的药液, 缓缓滴入纸片内, 平放于37℃恒温培养箱中培养18h , 观察纸片周围有无抑菌圈及抑菌圈大小。1. 3. 2. 2 最小抑菌浓度的测定 采用固体培养基
基:除液体培养基外, 每1000mL 加20g 琼脂,1×
) 高压灭菌20min , 备用。或采用45g 105Pa (121℃
营养琼脂配制1000mL 固体培养基。试验用抗菌肽是由中国农业大学农业部饲料工程中心提供的天蚕素抗菌肽产品, 有效含量为10%。1. 3 抗菌肽产品抗菌性能的测定
收稿日期:2008207207
作者简介:伍小松(1977-) , 男, 湖南人, 博士生, 研究方向:单胃
动物营养。
通讯作者:范志勇(1973-) , 男, 副教授, 山西人, 研究方向:动物
营养生理调控和饲料资源开发与利用研究。E 2mail :
fzyong04@163.com
连续稀释法(陈文伟等, 2005; 冯家伍, 2007) , 取
3. 90625～1000μg/mL 9个浓度样品8mL 分别加到无菌培养皿中, 再加入12mL 保温于45℃水浴中已灭菌的培养基, 充分摇匀, 冷凝, 待用。各平板中样品的最终浓度为:400、200、100、50、25、12. 5、6. 25、3. 125μg/mL 。用移液枪吸取各试验菌液2mL , 接种于各药液的培养基上, 每点含菌量约为104～105CFU/mL , 在37℃恒温培养箱中培养18h , 观察记录对各菌的最小抑菌浓度。
1. 3. 3 抗菌肽产品热稳定性的测定 将配制好的
各浓度药液分别于100℃的沸水中水浴5、10、15、20、
30min , 然后检测其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。1. 3. 4 p H 对抗菌肽产品活性的影响 将3500
μg/mL 的抗菌肽药液用三氟乙酸依次调整p H 至4. 0、3. 0、2. 0、1. 0, 再测定其对金黄色葡萄球菌的抑制活性。2 结果与分析2. 1 抗菌肽抗菌性能的测定2. 1. 1 抗菌肽的抑菌效果 试验结果显示(图1) ,
大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑
菌效果存在明显差异。其中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均出现抑菌圈, 但是三者只有金黄色葡萄球菌结果更为明显(14. 5mm ) , 大肠杆菌(11mm ) 和沙门氏菌(10mm ) (极不明显, 只有类似的痕迹) 抑菌圈直径较小, 且在圈内出现细菌, 只是不及培养基内数量。链球菌经多次试验均没有抑菌圈出现, 说明该抗菌肽产品对于链球菌没有抑制效果
。
抗菌肽产品抗菌活性试验
注:1为大肠杆菌;2;3为沙门氏菌。
2. 1. 2 最小抑菌浓度的测定 采用1. 953125～500μg/mL 9个浓度测定最低抑菌浓度时, 均没有
此可见, 抗菌肽产品具有较好的耐酸性能, 但随着p H 降低抗菌活性减弱
。
抑菌圈出现, 所以改用1000～5000μg/mL 9个浓
度, 发现出现抑菌圈, 但并不是随浓度的升高抑菌圈直径逐渐增大,3种菌的最低抑菌浓度见表1。
μg/mL ) 表1 抗菌肽产品对各种细菌的最小抑菌浓度(
试验菌种 大肠杆菌
沙门氏菌
金黄色葡萄球菌
最小抑菌浓度
[1**********]0
2. 2 抗菌肽产品热稳定性的测定 将配制好的各
浓度药液分别经100℃的沸水水浴5、10、15、20、30min , 然后检测其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性(图2) 。结果表明, 沸水浴5、10、15min 后抗菌肽产品
仍具有较好的抗菌性能, 沸水浴20、30min 后虽然发现类似于抑菌圈的环, 但是在该环内出现细菌, 且环的形状不规则,30min 后该现象更为明显。说明抗菌肽产品对高温具有较强的耐受性, 但在高温条件下, 随着时间的延长, 其对金黄色葡萄球菌的抑制性能逐渐减弱或消失。
2. 3 p H 对抗菌肽产品抗菌性能的影响 抗菌肽
产品溶液经过p H 4. 0、3. 0、2. 0、1. 0处理后, 观测其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(图3) 。结果发现,4种p H 对其抗菌性能均没有太大影响, 但p H 为1. 0时抑菌圈最小, 且圈内有一定细菌出现。由
3 讨论
3. 1 抗菌肽产品抗菌性能和最小抑菌浓度 本试
验结果表明, 该抗菌肽产品具有一定抗菌性能, 对金
黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌产生一定抗性, 其中以对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳, 另外两种的抑菌圈均不明显, 说明不同的细菌对其敏感性不同。由于采用1000μg/mL 及以下倍比稀释的浓度做抗菌活性的测定时, 试验中没有发现抑菌圈, 所以选择加大浓度, 重新筛选适合的抑菌浓度做抗菌活性的测定。经最小抑菌浓度试验结果发现, 对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为3500μg/mL , 大肠杆菌为4500μg/mL , 综合各项指标后, 确定采用3500μg/mL 作为最佳浓度, 既可以保证良好的抑菌效果, 又可以节约抗菌肽产品。彭蓉等(2002) 性能, 结果发现, 性, 菌, , , 但抑菌活性以大肠杆菌、白色念珠菌最佳(+++) , 金黄色葡萄球菌次之(++) , 其他菌种再次之(+) 。刘慧明等(2008) 试验结果证明, 鲎抗菌肽对隐球菌(+++) 和枯草杆菌(+++) 有抑制作用,24h 最
菌肽产品性质和浓度不同。粉纹夜蛾离体细胞抗菌肽为三氟乙酸提纯的粗产品, 刘忠渊等(2004) 使用的新疆天蚕素为通过酵母表达系统所表达的产物, 浓度为330mg/mL , 二者有效浓度均远远高于本试验所采用的天蚕素产品(有效成分仅为10%, 且不能完全溶于水) , 浓度的差异直接导致抑菌活性的不同。但该产品与其他抗菌肽或同类天蚕素粗提物的活性差异的原因还有待进一步研究。3. 2 温度和p H 对抗菌肽产品活性的影响 许兵红等(2005) 研究结果发现, 果丝光绿蝇幼虫经针刺诱导的抗菌肽100℃水浴1min 后仍有抗菌活性, 100℃处理3min ; 但80及60℃水浴5min , , 且不同温度, 包括牛乳酪蛋白来源抗菌, 经60℃处理活性基本无影响, 但随温度升高, 活性逐渐下降(陈青等,2005; Wang 等,1998) 。刘忠渊等(2004) 研究结果发现, 等体积0. 1mol/L 的HCl 与新疆天蚕素抗菌肽的混合物随着HCl 浓度的增加, 抗菌肽的作用逐渐减弱, 当HCl 浓度达到0. 4mol/L 时, 所产生的抑菌圈, 主要起作用的是HCl , 当HCl 浓度达到0. 5mol/L 时, 抗菌肽的活性受到抑制。稻蝗抗菌肽经三氟乙酸逐级调节p H 至5. 0、4. 5、4. 0、3. 5、2. 5, 静止30min 后, 以12000r/min
小抑菌浓度为2. 28μg/mL , 枯草杆菌的最小抑菌浓
度为45μg/mL , 而对变形杆菌无效。此外, 还有大量研究结果表明, 对于不同种类的抗菌肽, 其抗菌性能和最小抑菌浓度也不同(周义文等,2008; 陈青等, 2005; 陈丽颖等,2005) 。究其抗菌机理, 一般认为是抗菌肽能改变或破坏细菌质膜结构, 导致膜穿孔形成离子或溶质通道, 引起细胞内容物大量渗出, 最终导致细菌死亡(Dekker 等,2001) 、抑制细菌的呼吸作用(Fehlbaum 等,1996) 和蛋白质的合成(Carls 2son 等,1991) 等。
本试验中4种细菌对于该天蚕素类抗菌肽产品的敏感性也证实了这一点。但是, 该产品对大肠杆菌的抑菌效果与以往研究存在一定差异, 即对大肠杆菌同样表现出一定抗性, 但作用不太强烈, 抑菌圈较小, 对链球菌则无抑制效果, 这其中原因归结为:①抗菌肽品种和结构均不相同, 天蚕素分子质量约为4ku , 为线性分子, 表现出较强的阳离子特征, 且缺乏分子内二硫键(王燕等,2007) , 相比其他种类抗菌肽, 其一级结构(即氨基酸残基排列顺序、数目、种
αββ类) 、二级结构(2螺旋、2转角、2片层) 表现出明显
差异, 结构不同直接导致性质的不同。②所选用抗
离心15min , 去除沉淀蛋白, 取上清真空干燥后, 用
无菌水定容至原体积, 进行抑S. aureus , M. l yso 2dei kticus 菌试验, 发现其抗菌活性并未发生明显变化, 说明稻蝗抗菌肽对于低p H 具有较高的耐受性。
本试验中天蚕素类抗菌肽产品经高温处理被证明也具有良好的热稳定性和耐酸性, 在100℃的沸水中水浴5、10、15、20、30min , 然后检测其对金黄色葡萄球菌的抑制活性, 发现其在沸水浴5～15min 后仍表现出较好的抗菌活性, 但是在30min 的
沸水浴后, 抑菌圈极小, 且周围有细菌分布, 说明随着时间的推移, 其二级结构发生改变, 肽类变性, 抗菌活性也逐渐丧失, 与前面学者研究一致; 该产品对酸性环境也具有较好的耐受性, 在配制成溶液后其就表现为酸性(p H 为4. 0) , 用三氟乙酸调整p H 至3. 0、2. 0、1. 0后,4种环境下均表现出一定的抗菌性
能, 但随着酸度的降低, 活性也随之降低, 提示该产品可以在动物体内忍受胃中酸性环境, 从而保证抑菌性能。
3. 3 天蚕素抗菌机理 细菌因为有细胞膜与细胞
壁的存在, 对抗菌肽也存在一定抵抗力, 且含有的脂多糖(L PS ) 对于抵抗抗菌肽具有重要作用, 如果减少革兰氏阴性菌脂多糖的净负电荷, 可以降低细菌与抗菌肽的亲和力(Andreas 等, 1996; An 等, 2006) 。从以往报道的文献可以得知抗菌肽有多种抗菌机理, 如:①抑制细菌的呼吸作用, 使线粒体出现肿胀、空泡化、嵴脱落和排列不规则, 核膜界限不清, 内容物溢出等现象(Fehlbaum 等,1996) 。②抑制细胞壁的合成, 使其不能维持正常的细胞形态而生长受阻, 并使细胞壁穿孔, 最终导致细菌死亡, 但对已形成的细胞壁不起作用(Harder 等,2001) 。③抑制蛋白质的合成, 使蛋白质合成量减少, 导致细胞膜的通透性增加, 细菌的生长受到抑制(Carlsson 等,1991) 。④穿膜作用, 破坏其膜或胞内结构, 细胞的功能, 导致细菌死亡(Park ; 等,2006) 。
, 破坏膜结构。通过其两亲性α22螺旋上的正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而聚集在质膜上, 打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序, 使膜外正电荷增多, 超过阈值导致膜去极化。由于抗菌肽分子的α22螺旋是两亲性的, 所以当抗菌肽分子相互聚集在一起时可形成离子通道, 导致阳离子外流, 最后细菌失去保护, 不能保持正常的渗透压而死亡(Boman 等,1993; Wang 等,1998) 。但这一过程与环境p H 有关, 且p H 是抗菌肽溶解脂粒能力的主要决定因素,p H 偏中性时, 抗菌肽和膜的结合力最强, 随着酸度降低, 结合力逐渐降低, 活性也逐渐丧失, 本试验结果也证明了该点。另外, 多数抗菌肽的等电点大于7, 表现出较强的阳离子特性, 对较大的离子强度和较低的p H 均具有较强的抗性, 这才使得其在饲料工业和畜牧业中应用成为可能。天蚕素具有抗细菌、真菌(张谨华等,2005; Hao 等,2005;Andreu 等,1992; 任海涛等,2006) 、病毒(Albiol 等,2004) 和肿瘤(Michae 等,1998) 的功效, 其已在生物农药、医药、农业生产中有一定应用。医学上其中引起人们最大兴趣的是天蚕素的抗H IV 功能(沈益等,2007) , 而在畜牧业上, 天蚕素则被期望作为添加剂添加于饲料中, 提高动物免疫力和生产性能。目前, 不仅仅是天蚕素类抗菌肽产品, 其他种类抗菌肽如要应用于畜牧业, 仍有一些问题亟待解决, 如产品大量生产的问题, 从现有的资料和试验来讲, 通过基因工程进行改造、利用各种表达体
系广泛表达抗菌肽是未来解决该问题的有效途径
(扈进冬等,2006; Cereghino 等,2000; Michael 等, 1996) ; 商品化生产的问题, 以往抗菌肽在动物上的应用都集中于其粗提物或纯提物, 效果都非常明显, 但这必将导致产品价格过高, 不适用于饲料行业, 饲料行业希望得到的是效果较好、价格低廉、能进行商品化大规模生产的抗菌肽; 有关合适添加剂量的报道很少, 也限制了抗菌肽在饲料行业的应用。上述问题有待进一步研究解决。4 结论
本试验结果证明, 天蚕素类抗菌肽产品具有以下特性:①良好的抗菌性能, 对金黄色葡萄球菌具有, , 4500、3500、②, 经高温处理5～15min , 但随着时间推移, 活性逐渐丧失。③耐酸性, 当p H 降到1. 0时仍表现出一定抗菌活性, 足见其对酸性环境的耐受性。
参
考
文
献
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WU Xiao 2song 1, L UO Zhen 2f u 1, L I J un 2bo 2, YAN G Dan 2dan 1, H E Jian 2hua 1, FAN Zhi 2yong 1
(1. College of Animal Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, China ;
2. R &DCenter , Tangrenshen Group , Zhuzhou 412002, China )
Abstract :This paper was supposed to study the effects on inhibiting and killing common pathogenic bacteria of cecropin product by determining its antibacterial and antibiosis properties. The results indicated that this product had inhibitory effects on Escherichiacoli , S almonelladerby , S tap y lococcusaureur , and their minimal inhibitory concentrations were respectively 4500,3500,3500μg/mL ; additionally , it presented excellent heat resistance and acid resistance. Therefore , 3500μg/mL in di 2ets of experimental animal was recommended.
K ey w ords :cecropin ; antibacterial property ; acid resistance ; heat resistance
书 讯
《饲料检验手册》每本35元《饲料分析与检验》, 每本34元, 如有订购者, 请汇款到:100193 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 《中国畜牧兽医》编辑部收。